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植酸在多种植物组织中为磷的主要储存形式,占总磷量的50%-82%,具有较强的络合能力,易与植物中的二(三)价离子以及蛋白质结合生成不溶性的复合物,植酸盐类不能被植物直接吸收,降低了植物对各类离子的利用率。植酸酶又称肌醇六磷酸酶,一类特殊的正磷酸单酯磷酸水解酶,能将肌醇六磷酸分解成为低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸,提高了磷的利用率、解除了植酸的抗营养作用及减少磷对环境的污染。本研究从土壤中筛选分离出一株新的产植酸酶的脉胞霉菌株,优化了产酶条件,并对其进行了分离纯化以及研究了其酶学性质。而后采用PCR扩增的方法,获得了部分植酸酶基因序列,构建了原核表达载体,测定了了表达产物的酶活;并构建出植物表达载体,通过农杆菌介导法将植酸酶基因转入到受体材料烟草中,检测了转基因烟草中植酸酶的活性。主要研究结果如下:1.产植酸酶菌株的筛选与其产酶条件的研究本研究利用产植酸酶菌株可以在含有植酸钙的筛选培养基上形成水解透明圈而进行菌株的初筛与复筛,得到了产植酸酶较高的菌株。通过对该菌株的形态观察以及对其18S rRNA PCR扩增进行综合性比较,将该植酸酶产生菌初步鉴定为脉胞霉。对该菌的产酶条件进行优化研究,结果表明:产酶培养基最佳碳源为可溶性淀粉;氮源为酵母粉,在摇菌培养4d时,酶活性达到最高。利用正交试验对发酵培养基中的重要因素加以优化,得出其培养基成分为:植酸钙0.01g/mL;酵母粉0.018g/mL,可溶性淀粉0.0125g/mL;Mandel A液0.1mL/mL;Mandel B液0.0001mL/mL。2.植酸酶的纯化及性质研究脉胞霉菌株经液体发酵培养后,离心获得粗酶液,经丙酮沉淀,变性及非变性聚丙烯胺凝胶电泳等纯化步骤获得的植酸酶,用SDS-PAGE检测为单一条带,其分子量约为35KD。该酶作用的最适温度为55℃;最适pH为5;植酸酶在55℃进行处理25和200min后,其残留的酶活为80.3%和70.5%。3.植酸酶基因的克隆及表达载体的构建提取植酸酶菌株的总RNA,采用3’RACE试剂盒对目的片段进行扩增。得到了可以编码植酸酶基因的部分序列,该序列长度为750bp,能够编码485个氨基酸。成功构建出原核表达载体pGEX4t-3-xphyA,进行IPTG的诱导表达,并且在38KD左右成功表达。成功构建出植物表达载体CPB-xphyA,并将其质粒转化到农杆菌EHA105中,获得了可以用于转化植物的含phyA目的基因的农杆菌菌液。4.农杆菌介导的烟草遗传转化通过农杆菌介导法将phyA基因转入到烟草中,经过1%的Bar筛选和PCR检测,获得了转基因烟草植株,证明了植酸酶基因已被成功的转入到烟草基因组中。对转基因烟草植株植酸酶活性的测定,初步证明了phyA基因在烟草根与叶中编码的植酸酶可以正确表达,并且转基因烟草根中所表达的植酸酶具有较好的活性。