用基因工程手段制备蛋白质最常用的是大肠杆菌表达系统，它有融合表达和非融合表达两种形式。将编码目的蛋白的基因与表达载体上能够高表达已知蛋白质或多肽的基因融合，是融合表达形式。这种表达形式有很多优点： 首先是容易做到目的蛋白的高表达；其次融合的蛋白质或多肽的亲水性或分子伴侣性质能使表达的融合蛋白易于溶解或复性；融合表达可以带有各种标签，便于纯化和鉴定等。因而融合表达成为研究蛋白质功能、研制基因工程蛋白质药物的常用手段。各生物技术公司构建的多种商售蛋白质融合表达载体也已经被广泛应用。但目前所用的融合表达载体有共同的缺点：带在目的蛋白上的标签蛋白不易被去除，融合的标签蛋白会在体内引起不必要的免疫反应或影响目的蛋白的活性和正常行径等。常用的酶学方法来切除标签，不仅费用昂贵，且效率不高，目的蛋白的回收率低。已知的化学裂解方法，如溴化氰法等，因其剧毒等原因又很少使用。 骨形成蛋白4（BMP-4）是骨形成蛋白家族的一员，人骨形成蛋白4 成熟肽（hBMP-4m）由l16 个氨基酸组成。BMP-4 具有多种生理功能，除了诱导骨组织的形成外，对造血组织的形成具有重要的诱导分化作用，对三系血细胞都有促进生长的作用，这种作用较其它BMP 持久，是一种长时间促进血细胞生长的因子。制备BMP-4 也面临一个选择合适的表达系统的问题。 用真核细胞表达，可以直接获得有活性的BMP-4，但其产量低，价格昂贵，只适用于实验室研究，难以大规模生产，制约了其临床应用。使用大肠杆菌系统其表达蛋白量大，生产纯化工艺较简单，不失为一种选择。本室曾克隆得hBMP-4m 的cDNA 编码序列，克隆入pDH2 载体，在大肠杆菌中进行非融合表达并纯化制备（已获得国家发明专利），但纯化步骤复杂，蛋白损失量大，收得率低。 本文用hBMP-4m 作为靶基因，构建了一种大肠杆菌甲酸水解融合蛋白表达系统。用此系统不仅能高效表达目的蛋白、还能减少表达产物的纯化步骤，并且获得的蛋白具有与非融合表达的hBMP-4m 相似的生物学功能。该系统也可用于其他蛋白的表达。 一、原核甲酸水解融合表达载体的构建 目的：构建能高效表达目的蛋白的甲酸水解融合表达载体。 方法：用PCR方法分别在hBMP-4m 基因的5’端加上编码Asp-Pro-Pro 酸水解肽的不同简并码序列，克隆入原核融合表达载体pRSET-B 中，转化大肠杆菌BL21 后进行诱导表达，SDS－PAGE 分析，观察融合蛋白的表达效果。 结果：成功构建9个不同简并码序列的酸水解肽融合表达载体，分别命名为pRSET-DPP-rhBMP4m 1~9；经诱导表达分析，只有在两个脯氨酸的密码子均为CCG 时，融合蛋白才能高效表达，表达量达到细菌总蛋白量的38.4％。 结论：改变表达肽链中段氨基酸密码子的碱基序列可以显著影响融合蛋白的表达效果。 二、甲酸水解融合表达载体的应用 目的：利用已构建好的甲酸水解融合表达载体系统大量表达并纯化PP-rhBMP-4m。 方法：用可高效表达的pRSET-DPP-rhBMP-4m 系统进行大规模发酵，包涵体洗涤后，溶解于8M 尿素变性液；利用镍离子亲和层析柱直接纯化融合蛋白，用甲酸裂解去除6×His-D 标签肽段；SDS-PAGE 分析目的蛋白，并进行蛋白含量测定，计算目的蛋白得率。 结果：经发酵、裂菌、洗涤等操作，融合蛋白纯度达到57％以上；经镍离子亲和层析柱纯化后，目的蛋白纯度为98％；目的蛋白得率为69.8％；甲酸裂解效率达到93％以上。 结论：我们构建的pRSET-DPP-rhBMP-4m 是一种可以有效去除融合标签，纯化目的蛋白的融合表达系统。 三、PP-rhBMP-4m 细胞活性检测 目的：检测氨基端带有两个脯氨酸的目的蛋白PP-rhBMP-4m 与非融合表达的目的蛋白rhBMP-4m 的生物学活性是否相当。 方法：分别用PP-rhBMP-4m 和rhBMP-4m 刺激骨髓基质细胞和带有荧光素酶报告基因的C2C12K5 及NIH3T3K2 细胞（国家发明专利号：ZL 01 1 31813.9）；MTT 法检测骨髓基质细胞增殖情况；检测用药前后骨髓基质细胞ALP 表达量的变化；检测用药前后C2C12K5 及NIH3T3K2 细胞荧光素酶活性的变化。 结果：两种蛋白均可促进骨髓基质细胞的增殖，并且ALP 值均有增高，两组间无显著性差异（p>0.05）；荧光素酶活性分析显示，不管是C2C12K5 还是NIH3T3K2都在被PP-rhBM-4m或rhBMP-4m刺激后荧光素酶活性有所增强，两种刺激因子无显著性差异（p>0.05）。 结论：PP-rhBMP-4m、rhBMP-4m 在细胞活性方面没有差异。我们在设计大肠杆菌融合表达载体时，利用甲酸水解位点（Asp-Pro）的同时，也利用了哺乳动物体内普遍存在的脯氨酰肽酶（Prolyl peptidases）能够切除肽链氨基端第二个氨基酸残基为Pro 的特点，设计了Asp-Pro-Pro三肽序列。用它连接标签蛋白和目的蛋白，即形成“标签蛋白－Asp-Pro-Pro－目的蛋白”的结构。在得到这样的肽链之后，首先可以利用甲酸水解去除标签蛋白，然后将氨基端带有两个脯氨酸（Pro-Pro）的目的蛋白放入动物体内，利用哺乳动物体内的脯氨酰肽酶将两个脯氨酸去除，最终使目的蛋白在体内发挥生物学效应。另外，我们构建的这种甲酸水解融合表达载体可用于多种蛋白质的表达和纯化，尤其适合于小分子肽的表达。因为融合蛋白能增加表达小分子肽的稳定性；Asp-Pro-Pro 这个结构又可以用于小分子肽之间的连接，构建小分子肽串联体，这样既可以克服小分子肽不易表达，不易检测等缺点，又可以利用这个三肽结构在纯化目的蛋白的同时得到小分子肽的单体，为小分子多肽的原核表达和高效率纯化提供一个思路。