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背景:多药耐药(MDR)是食管癌化疗失败的重要原因之一。过去的几十年里,用于治疗食管癌的化疗药物如顺铂、紫杉醇等化疗药物对食管癌的治疗效果仍不够满意,而原发或者继发MDR的发生往往限制了临床多种化疗药物的应用;近年来相关研究发现食管癌MDR与基因的表达或激活,以及microRNA等相关,但是食管癌MDR的复杂机制远未阐明。多项针对细胞应激反应的研究提示应激抵抗可促使肿瘤细胞在不利的环境中生存,亦有研究认为应激因素参与了肿瘤耐药现象。而近年来部分研究发现在细胞应激反应中常常伴有ATF5的表达上调,这提示ATF5是一个应激相关基因。但目前ATF5和肿瘤的相关研究相对较少;关于ATF5在食管鳞状细胞癌MDR中的作用亦无报道。目的:研究ATF5在食管鳞癌MDR发生中的作用以及其可能的分子机制。方法:1.ATF5在食管鳞癌MDR中的作用1)质粒瞬时转染食管癌细胞调节ATF5蛋白表达,构建不同表达量的ATF5蛋白表达组;2)用Western blot实验检测各组ATF5蛋白表达组蛋白水平;3)用MTT实验检测ATF5高表达组、对照组及低表达组食管癌细胞在体外对不同药物的敏感性差异;4)采用DAPI核染色实验,来研究测试不同的ATF5蛋白表达组细胞对化疗药物的凋亡反应差异;5)利用平板克隆实验检测ATF5蛋白不同表达组细胞对紫衫醇、顺铂作用后增殖数的差异。2.ATF5与STAT3的相关性研究1)用脂质体转染法转染食管癌Eca-109细胞,构建高中低三组ATF5不同表达量的细胞;2)Western blot检测ATF5和STAT3蛋白的表达;3)相关系数分析不同组Eca109细胞ATF5表达量及不同ATF5表达量细胞组STAT3蛋白表达量间的相关性。3.STAT3在ATF5诱导食管鳞癌MDR发生中的作用研究1)转染ATF5蛋白高表达组细胞,调节STAT3蛋白表达,构建ATF5蛋白高表达组细胞不同STAT3蛋白表达量细胞组;2)采用Western Blot实验方法检测不同组STAT3蛋白表达情况;3)平板克隆形成实验检测ATF5蛋白高表达的Eca-109细胞在下调STAT3表达并联合顺铂作用后,对照组及siSTAT3组平板克隆形成数;4)采用MTT实验检测ATF5高表达的食管癌细胞在调节STAT3表达后并联合紫衫醇、顺铂作用下,STAT3高表达组,对照组及STAT3低表达组细胞对药物敏感性差异;5)DAPI染色、流式细胞实验检测ATF5高表达的Eca109食管癌细胞在下调STAT3后并联合药物作用下凋亡差异。结果:1.ATF5蛋白可促进食管鳞癌多药耐药的发生并且阻断ATF5蛋白表达可有效逆转食管鳞癌多药耐药细胞对化疗药物的抵抗1)成功构建三组不同ATF5蛋白表达量的Eca109食管癌细胞组,Western blot验证转染效果满意;2)MTT药敏结果显示过表达ATF5蛋白可以增加食管鳞癌细胞对化疗药物的敏感性,而下调ATF5蛋白表达可降低食管鳞癌细胞对紫衫醇、顺铂的耐药性;3)DAPI染色实验表明高表达ATF5蛋白后食管癌细胞在化疗药物作用下凋亡细胞都减少了,低表达ATF5蛋白后食管癌细胞在化疗作用下凋亡细胞都增加了;4)平板克隆形成实验结果显示高表达ATF5蛋白的表达可增加Eca109细胞对化疗药物的耐受性,而低表达ATF5蛋白的表达可降低Eca109细胞对化疗药物的耐受性。2.ATF5与STAT3的表达量呈正相关性Western blot实验检测到细胞中ATF5高表达组细胞的STAT3蛋白表达较高,而Eca109细胞中ATF5低表达组细胞的STAT3蛋白表达低;相关系数分析不同组Eca109细胞ATF5表达量及不同ATF5表达量细胞组STAT3蛋白表达量间呈正相关性。3.STAT3在ATF5诱导的食管鳞癌MDR中发挥了重要的作用1)ATF5高表达的Eca-109食管癌细胞在siRNA下调STAT3后并联合顺铂作用下平板克隆率较对照组低.ATF5高表达的TE-1食管癌细胞在siRNA下调STAT3后并联合顺铂作用下平板克隆率也较对照组低。平板克隆形成的实验结果表明,STAT3表达的下调,无论是Eca-109或是TE-1食管癌细胞在顺铂作用下平板克隆数目相比较对照组有了明显的减少;2)MTT实验显示ATF5高表达的食管癌细胞在调节STAT3表达后并联合紫衫醇、顺铂作用下,STAT3过表达组细胞存活率更高,而低表达组与对照组相比存活率更低;3)DAPI实验表明转染了小干扰STAT3的食管癌细胞在顺铂、紫杉醇作用36 h以后DAPI染色显示细胞核染色和分裂的细胞明显增多;4)流式细胞实验检测显示,ATF5高表达的食管癌细胞在siRNA下调STAT3后并联合顺铂作用下凋亡增加。结论:1.ATF5介导了食管鳞癌细胞MDR的发生,将ATF5作为靶点为逆转食管鳞癌MDR提供了一个全新的途径。2.STAT3可能是ATF5转录激活的一个靶基因。3.在ATF5所致的食管鳞癌细胞MDR的发生发展中,STAT3参与并发挥了一定的作用。4.STAT3在ATF5诱导的食管鳞癌MDR中也可能起重要作用,其作用可能部分通过上调STAT3的表达而介导。