论文部分内容阅读
【目的】角膜位于眼球最前端,是重要的屈光介质。角膜上皮位于角膜组织最外层,对于维持正常视力和组织完整性非常关键。角膜上皮受到感染、损伤,则可能导致角膜云翳、斑翳甚至瘢痕,严重者产生视力障碍。角膜损伤后主要依靠角膜上皮细胞进行修复和愈合,因此角膜上皮细胞发挥出良好的迁移功能对于促进角膜损伤修复以及维持角膜健康稳态都具有重要意义。CXCL14是一种新型趋化因子,可以促进大鼠角膜损伤修的过程。本课题旨在通过慢病毒稳转系统建立人角膜上皮细胞CXCL14过表达和降表达细胞系,并检验CXCL14在体外对人角膜上皮细胞迁移功能的影响。【方法】1.人角膜上皮细胞的培养与鉴定常规培养人角膜上皮细胞系HCE-2[50.B1],通过光学显微镜观察比较,鉴定其角膜细胞的形态学特征,通过细胞免疫荧光染色,鉴定其对角膜特异性分子标志物CK3的表达情况。2.人角膜上皮细胞CXCL14过表达与降表达稳转细胞系的构建通过网上基因库查找CXCL14的克隆和沉默序列,构建载体质粒,并用慢病毒表达载体进行包装,转染HCE-2[50,B1],用对应的抗生素进行药筛,筛选出转染成功的细胞后保种冻存,常规培养1~2代后用Western blot检验目的蛋白的表达水平。3.CXCL14对人角膜上皮细胞的影响利用构建好的人角膜上皮细胞CXCL14过表达与降表达稳转细胞系分别与其空质粒对照组进行细胞划痕实验和Transwell迁移实验,统计数据。4.CXCL14对原代大鼠角膜上皮细胞的影响在无菌环境下取大鼠眼角膜上皮细胞进行培养,用慢病毒转染技术建立大鼠角膜CXCL14降表达稳转细胞系,Western blot验证其基因沉默情况,用该细胞系进行细胞划痕实验,统计数据。【结果】1.HCE-2[50.B1]的鉴定及培养HCE-2[50.B1]细胞呈卵圆形,铺路石状,符合角膜上皮细胞形态学特征,细胞免疫荧光染色后胞浆内有绿色荧光,证明其有CK3特异性表达。连续传代培养,细胞形态及特性表达稳定,适于进行下一步实验。2.CXCL14过表达与降表达细胞系的构建与鉴定HCE-2[50.B1]被转染后接受药筛约一周终止,剩余细胞经过培养传代,其形态与正常HCE-2[50.B1]细胞无显著差异,Western blot结果显示CXCL14过表达与降表达均相对于空载体组显著,降表达细胞系p LV-sh CXCL14 HCE-2及其对照细胞系p LV-RNAi-vector HCE-2,过表达细胞系p LV-CXCL14 HCE-2及其对照细胞系p LV-vector HCE-2构建成功。3.CXCL14可以促进人角膜上皮细胞迁移划痕实验12h和24h,p LV-sh CXCL14 HCE-2的愈合率均明显低于p LV-RNAi-vector HCE-2,p LV-CXCL14 HCE-2的愈合率均明显高于p LV-vector HCE-2,差异均有统计学意义。(P<0.05)Transwell迁移实验,p LV-sh CXCL14HCE-2的细胞穿出数约为p LV-RNAi-vector HCE-2的25%,p LV-CXCL14 HCE-2的细胞穿出数为p LV-vector HCE-2的1.6倍,差异均有统计学意义。(P<0.05)4.CXCL14可以促进大鼠角膜上皮细胞的迁移无菌环境下提取原代大鼠角膜细胞,常规培养、传代,用慢病毒转染构建从CXCL14降表达稳转细胞系sh CXCL14 CSC Rat,Western blot验证其CXCL14蛋白表达量下调明显。划痕实验显示,24h时,对照组大鼠角膜上皮细胞愈合率接近100%,而sh CXCL14 CSC Rat仅为20%,差异有统计学意义。(P<0.05)【结论】1.通过慢病毒载体系统转染人角膜上皮细胞系HCE-2[50.B1],可以发现CXCL14过表达细胞系和降表达细胞系,蛋白水平明显。2.CXCL14在体外能促进人角膜上皮细胞和大鼠角膜上皮细胞的迁移。