【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）至今仍是影响养猪业健康发展的主要疾病之一,作为高度流行性病毒,PRRSV的暴发带来了严重的经济损失。PRRSV传入我国后,较高的遗传性和重组率导致我国的流行毒株不断改变,使得PRRS更难以防控,为疫苗的研制也增加更多阻碍,目前市场上的疫苗仍不能完全控制PRRSV的入侵。本研究基
【基金项目】
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海南省省属科研院所技术创新专项“基于RPA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快检技术的研制与初步应用”（项目编号:jscx202001）； 国家自然科学基金项目“GP4和GP2a蛋白的N-糖基化修饰影响PRRSV感染入侵的机制研究”（课题编号:32060796）；
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）至今仍是影响养猪业健康发展的主要疾病之一,作为高度流行性病毒,PRRSV的暴发带来了严重的经济损失。PRRSV传入我国后,较高的遗传性和重组率导致我国的流行毒株不断改变,使得PRRS更难以防控,为疫苗的研制也增加更多阻碍,目前市场上的疫苗仍不能完全控制PRRSV的入侵。本研究基于重组酶辅助扩增技术（Recombinase aided amplification,RAA）结合荧光定量和免疫层析试纸条建立两种快速检测PRRSV的方法,在PRRSV ORF7区域设计带有探针的特异性引物,只需在短时间内恒温反应,即可检测到病原。成功构建PRRSV三个不同谱系p MD18T-ORF7真核表达载体。通过10倍连续稀释PRRSV质粒的拷贝数,验证PRRSV RAA方法的敏感性,结果表明:PRRSV RAA试纸法在9.9×1010-10~1copies/μl均可检测到;PRRSV RAA荧光定量法在9.9×10~9-10~6copies/μl可以检测到。通过和有呼吸症状的猪病毒的比较,证明PRRSV RAA方法的特异性,且不同谱系的PRRSV毒株均可检测到。从海南省不同猪场采集157份临床样本,利用PCR方法对比验证,检测RAA荧光定量法灵敏度和特异性分别为94.0%、100.0%,RAA试纸法灵敏度和特异性分别为100%、97.8%。实验室从RAA方法检测到的阳性样品中分离得到几株PRRSV,选择典型的两株毒测序命名为HNHK1-2021和HNLG1-2021。通过PRRSV ORF5基因组分析和进化树的构建,证明PRRSV HNHK1-2021株和HNLG1-2021株均属于北美型毒株,PRRSV HNHK1-2021株属于谱系3（QYYZ样PRRSV）,PRRSV HNLG1-2021株属于谱系5（VR-2332样PRRSV）。为进一步研究PRRSV作用机制,通过构建PRRSV ORF4 N-糖基化突变体,研究糖基化突变是否影响PRRSV与CD163受体的作用,成功构建p EGFP-ORF4和p RFP-CD163真核表达载体,通过激光共聚焦显微镜成功证明所有PRRSV ORF4 N-糖基化突变体均可以与CD163受体在空间上共定位,且两者均在细胞质中表达。本研究结果为研究PRRSV入侵机制提供理论基础。
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