微孢子虫是专性细胞内寄生的真核生物,可感染原生生物和哺乳动物,也包括免疫缺陷的人类。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是第一个被发现的微孢子虫,能感染家蚕造成微粒子病,给养蚕业带来巨大的经济损失。分子伴侣是一类蛋白质,在原核细胞和真核细胞中负责大量多肽的折叠。新合成的多肽在没有伴侣蛋白帮助的情况下容易发生非特异性的相互作用,形成有毒的聚集物。任何对蛋白质折叠过程的错误调控都会导致蛋白质错误折叠或与多种病理疾病相关的有毒聚集物的形成。含有伴侣蛋白的T复合多肽(chaperonin-containing T-complex polypeptide-1,CCT)是真核生物中主要的伴侣蛋白,它可以防止错误折叠和聚集,使蛋白质可以有效地折叠到其固有的功能构象。CCT以ATP依赖的方式帮助肌动蛋白、微管蛋白和许多其他细胞蛋白的折叠。研究家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT的功能对进一步了解蛋白质的折叠机制以及微粒子病的防治具有极其重要的作用。本文克隆得到了家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT复合体的亚基δ和η,制备NbCCTδ和NbCCTη抗体并和actin,tubulin进行了共定位,初步探索了NbCCTδ和NbCCTη的功能。我们克隆得到的NbCCTδ基因与NCBI数据库中的序列相似度为99.8%。序列分析结果显示,该基因长1 497 bp,编码498个氨基酸,其中56.43%为螺旋结构,22.49%的无规卷曲,13.86%的延伸片段,其余为转角。该蛋白质无信号肽,无跨膜结构域,有7个磷酸化位点,存在N-糖基化位点和O-糖基化位点。多重序列比对结果显示,家蚕微孢子虫CCTδ蛋白与其他微孢子虫CCTδ蛋白序列同源性较高,都在40%以上。依据CCTδ蛋白序列构建的进化树显示Nosema bombycis与Nosema ceranae和Nosema apis聚在同一分支上,表明它们可能有较近的亲缘关系。构建NbCCTδ重组蛋白表达载体体外表达NbCCTδ蛋白,NbCCTδ蛋白纯化后用于抗体制备。获得的抗体浓度为1.04 mg/ml,WB结果表明获得的NbCCTδ抗体能特异性结合家蚕微孢子虫总蛋白中的NbCCTδ蛋白。间接免疫荧光结果表明成熟孢子中存在NbCCTδ,发芽后NbCCTδ蛋白主要存在于孢原质中,在家蚕微孢子虫整个发育过程中NbCCTδ都存在于孢子的细胞质中,在孢子成熟的过程中逐渐向孢子边缘聚集。NbCCTδ与Nb-actin、Nb-β-tubulin蛋白的共定位结果显示,在家蚕微孢子虫整个发育早期NbCCTδ与Nb-actin共定位细胞质中,发育后期均往孢子边缘聚集,且Nbactin和NbCCTδ能完全重叠;同时,NbCCTδ也与Nb-β-tubulin共定位在细胞质中,但Nb-β-tubulin在孢子发育过程中并不总是均匀的分布在细胞质中,在家蚕微孢子虫孢子核分裂过程中Nb-β-tubulin主要聚集在孢子核周围,当核分裂结束后,Nb-β-tubulin逐渐聚集在孢子边缘。在孢子逐渐成熟的过程中,NbCCTδ、Nb-actin和Nb-β-tubulin都逐渐向孢子边缘聚集,可能和孢壁的形成和增厚有关。以上结果表明Nb-actin和Nb-β-tubulin与家蚕微孢子虫的骨架形成有关,Nb-β-tubulin还可能与孢子核分裂存在一定的关系,NbCCTδ参与了Nb-actin和Nb-β-tubulin的折叠组装。NbCCTδ基因转录特征分析结果显示,NbCCTδ在家蚕微孢子虫发育的早期就达到很高的转录水平,54 h后NbCCTδ的表达明显降低,之后NbCCTδ的表达量就保持在非常低的水平,说明NbCCTδ在孢子发育早期帮助新生蛋白的折叠。RNA干扰后,NbCCTδ的表达一直处于很低的水平,表明RNA干扰可以抑制NbCCTδ基因的表达。同时,RNA干扰使家蚕微孢子虫形态发生改变,可能是下调NbCCTδ基因导致NbCCTδ蛋白量明显下降,进而影响了细胞骨架蛋白的折叠和装配,因此,孢子不能形成其特有的形状。生物信息学预测NbCCTη蛋白二级结构中α螺旋占56.09%、延伸片段占13.70%、β转角占7.39%、无规卷曲占22.83%。NbCCTη没有信号肽,不存在跨膜结构域,存在磷酸化位点,有O-糖基化位点和N-糖基化位点。多序列比对结果表明,NbCCTη蛋白与Nosema ceranae中CCTη蛋白的同源性为60.71%,系统发育树也聚在同一分支上,说明二者存在着比较近的亲缘关系。我们克隆得到了NbCCTη基因,构建的原核表达载体表达的重组NbCCTη蛋白分子量约为58 k D。蛋白纯化后制备特异性抗体NbCCTη,间接免疫荧光结果表明,NbCCTη在家蚕微孢子虫整个发育过程中都能定位在细胞质中,在孢子成熟的过程中汇聚在孢子边缘。NbCCTη可与Nb-actin和Nb-β-tubulin在家蚕微孢子虫整个生命周期中进行共定位,但Nb-β-tubulin在孢子发育过程中并不总是均匀分布在胞质中,Nb-β-tubulin在核分裂的时候集中在核周围,说明Nb-β-tubulin可能和孢子核分裂存在一定的关系;而在孢子逐渐成熟的过程中NbCCTη、Nb-actin和Nb-β-tubulin都逐渐往孢子边缘汇聚,可能与孢壁的形成与增厚有关。本研究表明NbCCTη主要位于家蚕微孢子虫的细胞质中,在N.bombycis整个生活史中都存在,并且参与了Nb-actin和Nb-β-tubulin的折叠,在维持细胞骨架的和孢子结构完整性方面具有一定的作用。NbCCTδ和NbCCTη在家蚕微孢子虫整个生活史中都存在,且主要定位在细胞质中,能帮助肌动蛋白和微管蛋白进行折叠。CCTδ和CCTη也可能具有CCT复合体之外的其他功能,研究CCTδ和CCTη单体的功能对于全面了解CCT复合体的功能具有重要意义,有助于深入了解N.bombycis的增殖和发育过程,对防治家蚕微粒子病也具有一定的指导意义。