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无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),即B族链球菌(Group B Streptococcus),是一种能引发新生儿败血症、脑膜炎和肺炎等严重感染的β溶血革兰阳性链球菌;它也是一种成人条件致病菌,老年人、免疫缺陷者以及糖尿病和恶性肿瘤患者尤为易感。但随着抗生素的广泛应用,无乳链球菌耐药问题渐渐产生。因此,调查无乳链球菌的流行病学特点、耐药机制及耐药基因传播机制对防治医院感染和减缓耐药菌传播都具有重要的临床意义。本研究第一部分收集上海某医院短期内同一产科病房分离得到的6株无乳链球菌(4株来自新生儿血液:Sag7/Sag13/Sag37/Sag158;2株来自母亲阴道分泌物:Sag66/Sag142)。采用法国梅里埃公司MALDI-TOF MS进行菌种鉴定;采用纸片扩散法进行药敏试验;对菌株进行多位点序列分型(MLST)和脉冲电场凝胶电泳分型(PFGE),分析各菌株间的亲缘关系,判断是否为克隆传播,是否为院内感染;应用PCR方法检测其主要毒力基因,包括荚膜多糖、表面蛋白以及菌毛样结构。结果表明:Sag7/Sag13/Sag37/Sag66四株无乳链球菌的药敏结果一致,MLST分型为ST-12,PFGE为同一克隆型,血清型Ⅰb;Sag142/Sag158的药敏结果一致,MLST分型为ST-19,PFGE为另一克隆型,血清型Ⅲ。Sag7/Sag13/Sag37/Sag66四株菌含有表面蛋白bac、bca和alp2/3基因,而Sag142/Sag158则含有表面蛋白ε基因;六株细菌都含有菌毛样结构PI-1和PI-2a基因。结论:本研究通过分子流行病学分析证实了某医院新生儿病房内的一次无乳链球菌血流感染的爆发流行中既存在母婴垂直传播,又存在新生儿间的水平传播,因此加强推广孕产妇产前无乳链球菌筛查诊断及院内感染控制对预防新生儿无乳链球菌感染具有重要意义。第二部分中我们深入研究了上述第一部分中两株来自于新生儿血液标本的不同克隆型的无乳链球菌:Sag37和Sag158,通过Etest方法分别测定其红霉素,四环素,左氧氟沙星,克林霉素和青霉素的最小抑菌浓度(MIC),Etest结果表明:Sag37对红霉素,克林霉素和四环素高度耐药,对左氧氟沙星和青霉素敏感,而Sag158对四环素和左氧氟沙星耐药,对红霉素,克林霉素和青霉素敏感。以Sag37(E~R/LEV~S)作为供体菌和Sag158(E~S/LEV~R)作为受体菌进行接合实验;用红霉素(1mg/L)和左氧氟沙星(8mg/L)双抗平板进行筛选,获得了可能的接合子,接合子Sag158-1对红霉素、左氧氟沙星同时耐药,这表明供体菌Sag37能够将红霉素抗性转移至受体菌Sag158中。将Sag158和接合子Sag158-1的DNA用限制性核酸内切酶Sma I酶切后进行脉冲场凝胶电泳,以证实接合成功,并同时用S1核酸酶酶切Sag37的DNA,以排除Sag37中存在质粒的可能性;对Sag37和Sag158两株菌株进行三代全基因组测序,接合子Sag158-1进行二代测序,并通过软件对测序结果进行分析。我们在Sag37中发现了一种新型的可接合性转移原件(Integrating conjugative elements,ICE),命名为ICESag37,大小为73,429bp(位于Sag37染色体中629058-702486bp),预测含有79个ORF,ICESag37由丝氨酸家族整合酶介导特异性识别插入保守基因rumA(23S rRNA[尿嘧啶-5-]-甲基转移酶)中。ICESag37携带多种耐药基因,包括红霉素抗性[erm(B)]、四环素抗性[tet(O)]和氨基糖苷类抗性[aadE、aphA和ant(6)]的耐药基因,除耐药基因外,ICESag37还含有与猪链球菌毒性有关的基因,即双组分信号转导系统(nisK/nisR)。结论:国内外首次在无乳链球菌中发现并报道了一种可接合性转移原件ICESag37,该元件同时携带耐药基因和潜在毒力因子,可能是无乳链球菌中传播多重耐药性和致病力的重要媒介。第三部分中我们探讨了无乳链球菌中一种特殊的耐药表型:L表型,即对克林霉素耐药而对红霉素敏感。我们连续收集了瑞金医院2016-2018年各体液标本中检出的非重复性无乳链球菌186株,从中鉴定出两株具有特殊耐药表型L表型的无乳链球菌(L~R/M~S),Sag3和Sag27,其对红霉素敏感(MIC≤0.25mg/L),但对克林霉素(MIC≥1mg/L)耐药。使用全基因组测序方法,我们发现lnu(B)基因是介导这两株无乳链球菌L表型的原因,并且该基因的遗传背景在两种菌株中几乎相同。lnu(B)基因位于aadE-spw-lsa(E)-lnu(B)耐药基因簇中,而其上游存在另外的一个7-kb左右的tet(L)-cat耐药基因簇。这两个基因簇的两侧都有IS6家族插入序列IS1216。我们多次尝试将Sag3和Sag27作为供体菌进行接合试验,还选取了合适的引物尝试对多重耐药基因片段进行了反向PCR,以鉴定该片段是否存在中间环状形式,但接合试验和反向PCR都未成功。结论:本研究在国内首次发现了两株由lnu(B)基因介导的具有L表型的临床无乳链球菌分离株,该基因位于aadE-spw-lsa(E)-lnu(B)多重耐药基因簇上,IS1216在无乳链球菌lnu(B)耐药基因的传播中可能起着重要作用。综上,无乳链球菌能够引起严重的新生儿感染,而具有多重抗性的细菌更是抗感染治疗的主要问题。无乳链球菌能够借助可移动的遗传元件,包括插入序列,转座子和ICE等等,从广泛的细菌基因库中获得耐药基因来抵抗抗生素治疗。这些原件在水平基因交换中发挥了核心作用,促进了抗性基因的获得和传播,加剧了无乳链球菌的耐药问题,也增加了临床用药的难度,因此我们应选择适当的药物治疗无乳链球菌感染,实时监测耐药菌株分子特征,探索细菌耐药及其播散机制,同时也应推广孕妇产前无乳链球菌筛查,并加强医院感染的防控。