性别决定作为重要的生物学过程,一直是生物学、繁殖学、发育生物学和动物科学研究的热点问题。由于经济动物雌雄性在生产力和经济效益上的差异,因此,研究性别决定的机制,实现性别鉴定与控制也成为生产中的一个重要问题。鸡是重要的经济和模式动物,它既可以作为易于获取的模型动物用于科研工作,又是人类优质的动物蛋白来源。鸡的性别与其生产效益密切相关,在肉鸡生产中,公鸡的生产效益高于母鸡,而在蛋鸡生产中,母鸡的生产效益则远高于公鸡。因此,如果能够通过对性别的调控,在肉鸡生产中获得单一性别的公鸡,或在蛋鸡生产中产生单一性别的母鸡,则可以大量降低因雏鸡淘汰带来的养殖成本,这将为整个养殖行业带来巨大的经济效益,也避免了因雏鸡淘汰而带来的伦理问题。因此,实现鸡的性别控制是目前家禽养殖业亟需解决的关键问题。众所周知,在哺乳动物中,性别决定的关键基因已经被挖掘。小鼠中Sry基因能够特异性地决定雄性发育。虽然家禽中也有相关基因被发现,比如Dmrt1、Amh以及Foxl2等,但是后续的实验证明这些基因只能参与家禽的性别决定过程,而并非关键基因,这极大地限制了鸡性别控制技术的开发和应用。基于此,本研究在前人研究基础上,利用转录组测序技术,系统分析了鸡胚胎性别决定过程中关键时间点的基因表达和影响因素,发现并鉴定出鸡W染色体上Hintw基因是鸡性别决定过程中的关键基因,通过体内外实验证明其在性别决定中的生物学功能,并对其分子机制进行了探究。为鸡（鸟类）性别决定机制的研究提供参考依据,并为后续深入研究鸡性别决定调控网络提供了理论支撑。研究结果如下:（1）转录组分析鸡性别决定的关键因素 对鸡胚发育早期的雌雄胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）进行了转录组测序,发现在早期囊胚中（ESCs）就已经出现性别基因表达差异,说明鸡的性别决定在胚胎发育早期（ESCs阶段）就已经开始。通过GO（Gene Ontology）分析,确定能量代谢和表观遗传修饰（DNA甲基化和组蛋白乙酰化）参与了鸡的性别决定过程。确定了 pathway in cancer,Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 和 Drug metabolism-other enzymes等三条信号通路在鸡性别决定过程中发挥重要作用。通过基因互作,初步确定鸡性别决定过程中的关键基因为Cyp19a1、Dmrt1、Sox9、Amh、Hintw和Wnt4。（2）能量代谢和表观遗传修饰在鸡早期性别决定过程中的功能研究 对雌雄ESCs和鸡胚成纤维细胞（Chicken Embryo Fibroblast,CEF）中葡萄糖摄取和乳酸堆积水平进行检测,发现雄性ESCs和CEF中糖酵解水平较高,而雌性ESCs和CEF中糖酵解水平较低。通过ELISA检测雌雄ESCs和CEF中组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase,HAT）的水平,发现雄性细胞中的HAT水平显著高于雌性细胞（P<0.01）。利用5mC抗体对雌雄ESCs的基因组进行斑点杂交实验,发现雄性ESCs的DNA甲基化水平显著低于雌性（P<0.01）。通过鸡性腺体外培养过程中添加糖酵解激活剂（2i:SB431542+PD0325901）、组蛋白去乙酰化修饰酶抑制剂（valproic acid,VPA）和DNA甲基化抑制剂（Vitamin C,Vc）进行功能实验。HE染色结果显示:与正常发育的雌雄性腺相比,添加2i、VPA或Vc处理后,卵巢的皮质明显变薄,髓质变得更加致密,出现曲精细管的形态结果。qRT-PCR结果显示,与正常的卵巢或睾丸相比,添加2i、VPA或Vc处理后的卵巢和睾丸中Sox9和Amh都出现显著地上调（P<0.05）,而Foxl2和Wnt4则显著下调（P<0.05）。通过ELISA检测性激素,发现2i、VPA或Vc处理能够抑制卵巢和睾丸中的雌二醇水平并提高睾酮的水平（P<0.01）。因此,激活糖酵解能够促进雄性性别决定过程,而抑制DNA甲基化修饰水平和提高组蛋白乙酰化修饰水平也可以促进鸡雄性性别决定过程。（3）鸡性别决定的关键基因筛选 通过建立体外CEF重编程体系获取与ESCs相似的iPS,并以此为体系利用糖酵解激活剂（2i:SB431542+PD0325901）、DNA甲基化抑制剂（Vc）以及组蛋白去乙酰化修饰酶抑制剂（VPA）处理CEF优化iPS重编程过程。成功收集雌雄CEF以及不同诱导条件下获得的iPS样本,获得了高质量的总RNA。通过转录组测序（Illumina测序）技术检测了能量代谢、DNA甲基化和组蛋白乙酰化处理对性别相关基因的影响,并从基因水平上比较了两性性别决定过程中的差异基因表达变化,发现添加2i激活糖酵解水平后能够促进细胞雄性决定过程,添加Vc降低细胞内DNA甲基化水平和添加VPA提高组蛋白乙酰化水平,也能够促进细胞雄性决定过程。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）和 GO 分析显示,在雌雄CEF重编程过程中2i和Vc/VPA调节雄性性别决定过程基因或信号通路是保守的。同时,通过对雌雄CEF重编程过程中的候选基因进行韦恩分析,发现2i和Vc/VPA调节鸡性别决定的关键候选基因45个。最后,结合鸡雌雄ESCs阶段出现的关键性别候选基因进行互作分析,发现Hintw是鸡胚的性别决定过程调控网络的核心。（4）Hintw在鸡性别决定中的功能研究 系统检测了Hintw在鸡雌雄细胞、早期胚胎和性腺发育过程以及雏鸡不同组织中的表达水平,发现Hintw在鸡的两性中存在截然不同的表达规律,在鸡雌性胚胎和性腺发育过程以及组织中均高表达,而在雄性胚胎和性腺发育过程以及组织中均低表达。成功构建Sh-Hintw慢病毒干扰载体和OE-Hintw慢病毒过表达载体,二者能显著干扰或提高Hintw的表达。通过体内功能验证试验发现,在雄性鸡胚中过表达Hintw后,会导致18.5d的睾丸出现不对称发育,HE染色结果显示:与正常发育的雌雄性腺相比,过表达Hintw的雄性性腺的皮质明显增厚,睾丸中的曲精细管出现崩塌,内部变得疏松,呈现出卵巢的形态结果。而干扰Hintw的雌性性腺皮质明显变薄,卵巢的髓质中出现曲精细管的形态结果。qRT-PCR结果显示,过表达Hintw后能够显著抑制鸡胚中雄性相关基因Dmrt1、Sox9和Amh的表达（P<0.05）,促进雌性相关基因Cyp19a1和Foxl2的表达（P<0.05）;干扰Hintw后则出现完全相反的结果。同时,雄性鸡胚中过表达Hintw后能够抑制睾酮水平,而提高雌二醇的水平,但是在雌性鸡胚中干扰Hintw后则抑制雌二醇的水平,提高睾酮的水平。这些结果表明Hintw参与了早期鸡胚的性别决定过程,这为进一步阐明鸡胚性别决定过程的分子调控网络奠定基础。（5）Hintw在鸡性别决定中的分子机制研究 通过Pull down和质谱检测成功获取了 HINTW的互作蛋白UBE2I。利用CoIP进一步验证发现,在雌性的细胞中HINTW能够与UBE2I结合,而HINTZ无法与UBE2I结合。检测了Ube2i在鸡胚中的表达规律,发现Ube2i在雌性组织中的表达水平显著高于雄性（P<0.01）,且在雌性的卵巢中表达量显著高于其他组织。通过慢病毒介导过表达/干扰Ube2i进行体内功能试验发现,过表达Ube2i后,雄性鸡胚睾丸皮质发育,髓质呈现疏松结构,曲精细管减少,呈现雌性性腺特征,同时,Foxl2、Hintw、Cyp19a1等雌性相关基因表达极显著上调（P<0.01）,而Sox9、Dmrt1、Wt1等雄性相关基因表达显著下调（P<0.05）,并且雄性鸡胚中雌二醇含量整体高于对照组,睾酮含量低于对照组,而干扰Ube2i的表达后,则出现相反的变化趋势。说明Ube2i能够有效地促进鸡胚向雌性方向分化。综合上述结果,本实验成功筛选并鉴定出Hintw可作为鸡雌性性别决定过程中的关键基因,其通过与雌性性别相关基因（Ube2i）发生互作参与鸡胚早期的性别决定过程,本实验结果为进一步解析鸡性别决定的分子机制奠定了理论基础。