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甲状腺是哺乳动物体内非常重要的内分泌器官,其分泌的甲状腺素和降钙素对人和动物的生长发育必不可少。随着生活方式的改变和年龄的增加,甲状腺疾病无论在宠物还是人体内均呈日益增加趋势,其中甲状腺癌是非常常见的内分泌系统的肿瘤,该病的发病率逐年上升。外科手术、放射性碘和甲状腺激素等常规治疗在大多数患者身上效果较好,但对未分化型甲状腺癌没有明显效果。乳头状甲状腺癌是最常见的一种甲状腺癌,约占所有的甲状腺癌的80%。BRAF基因在乳头状和未分化甲状腺癌中40-60%频率突变。尽管B-Raf激酶抑制剂（PLX4032）对BRAF基因突变的黑色素瘤有很好的疗效,但对甲状腺癌疗效甚微,其分子机制仍有待进一步研究。未分化型甲状腺癌中的肿瘤干细胞比例显著高于分化良好的甲状腺癌。肿瘤干细胞对肿瘤转移、复发、耐药性以及抗放射性治疗中起关键作用。BRAF激酶抑制剂是否促进甲状腺肿瘤干细胞的自我更新发挥其耐药机制仍没有研究报道。Shh信号通路在细胞分裂增殖和器官形成的发育过程中起重要作用。Shh信号通路通过其配体（Sonic、India、deserted hedgehog）结合至细胞表面的受体Patched（PTCH）,导致另一个跨膜受体Smoothened（SMO）和下游的Gli1转录因子激活。Shh信号通路在多种肿瘤包括甲状腺癌中过度激活并促进肿瘤细胞的生长侵袭和肿瘤转移。本实验室的前期工作发现,Shh信号通路能调控甲状腺肿瘤干细胞的自我更新并降低肿瘤细胞对药物的敏感性,但分子机制仍不清楚。本文将应用体外细胞培养和小鼠模型研究Shh信号通路调控甲状腺肿瘤干细胞自我更新的分子机制;研究B-Raf激酶抑制剂在甲状腺肿瘤中是否通过Shh信号通路调控甲状腺肿瘤干细胞自我更新发挥其耐药机理;研究B-Raf激酶和Shh信号通路抑制剂联合使用是否具有协同拮抗肿瘤的效果。1、Shh信号通路调控甲状腺肿瘤干细胞的机理研究我们首先研究了 Shh信号通路抑制剂是否影响两个甲状腺癌干细胞的关联基因（BMI1和SOX2）的表达。体外实验用未分化甲状腺癌细胞SW1736和KAT-18细胞进行,用Shh信号通路抑制剂处理细胞,结果显示:1)Shh信号通路抑制剂GANT61和Cyclopamine（CP）能抑制未分化甲状腺癌细胞系KAT-18和SW1736的BMI1和SOX2表达;2)siRNA沉默Shh与Glil后,BMI1和SOX2的表达随之下调;3)过表达Gli1和Snail后,增加了 BMI1和SOX2的表达;4)GANT61和CP下调Gli1与SOX2的启动子活性与mRNA水平,但对BMI1的启动子活性与mRNA水平没影响;5)ALDH阳性细胞中Gli1与BMI1和SOX2的表达水平增加;6)免疫组化分析临床甲状腺肿瘤样本发现,BMI1和SOX2在甲状腺乳头状癌和未分化癌中高表达,并与Glil表达相关。这些结果表明Shh信号通路通过上调BMI1和SOX2促进肿瘤干细胞的自我更新。体内试验使用重度免疫缺陷的NCG小鼠为模型,结果显示,1)ALDH阳性细胞致瘤能力明显高于未分选的肿瘤细胞;2)GANT61在甲状腺肿瘤干细胞小鼠模型中抑制肿瘤的发生和生长;3)GANT61治疗降低肿瘤组织中Gli1,ALDH,BMI1和SOX2的表达;4)GANT61治疗小鼠降低了肿瘤组织中干细胞的比例。这些结果表明Shh信号通路促进甲状腺肿瘤干细胞自我更新和肿瘤发生。2、甲状腺癌介导B-Raf激酶抑制剂药物抵抗的分子机制我们进一步研究了 Shh信号通路是否参与B-Raf激酶抑制剂在甲状腺肿瘤中药物抵抗。体外实验用BRAF基因突变甲状腺癌细胞SW1736和8585C、BRAF基因未突变甲状腺肿瘤细胞WR082、BRAF基因突变黑色素瘤细胞A375细胞进行,用B-Raf激酶抑制剂PLX4032处理细胞,结果显示:PLX4032能在甲状腺肿瘤细胞中反馈性激活MAPK和PI-3K信号通路,并增加与肿瘤转移相关基因的表达;PLX4032上调了与干细胞相关基因BMI1和SOX2的表达;PLX4032能增加甲状腺肿瘤细胞中ALDH阳性细胞率和肿瘤微球数量;加入Her3和AKT的抑制剂Lapatinib和MK-2206下调了与肿瘤干细胞相关基因BMI1和SOX2的表达,降低了 ALDH阳性细胞率,减少了肿瘤微球数量;同时,Lapatinib和MK-2206降低了 Gli1和SOX2的启动子活性与mRNA水平,但对BMI1的启动子活性与mRNA水平没影响;与PLX4032共作用可以降低由其引起的增加;PLX4032与GANT61共作用可显著降低肿瘤干细胞相关基因的表达。体内试验以免疫缺陷的NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠为模型,结果显示:PLX4032在体内激活PI-3K信号通路,并增加与干细胞相关基因BMI1和SOX2的表达;PLX4032增加瘤体中ALDH阳性细胞率;PLX4032与GANT61联合用药显著抑制了肿瘤的生长。这些结果表明,B-Raf激酶抑制剂通过促进甲状腺肿瘤干细胞自我更新发挥其药物抵抗作用,与Shh信号通路抑制剂联合使用,可以抑制甲状腺肿瘤的生长。综上所述,Shh信号通路通过诱导甲状腺癌中SOX2和BMI1表达促进肿瘤干细胞的自我更新;Shh信号通路抑制剂能抑制甲状腺CSCs驱动的肿瘤生长。B-Raf激酶抑制剂PLX4032通过Her3激活MAPK或PI-3K通路,交叉激活Shh信号通路,促进甲状腺肿瘤干细胞自我更新,从而发挥药物抵抗作用。PLX4032与Gli1的抑制GANT61剂联合用药,具有协同抗肿瘤作用。本研究阐明了 Shh信号通路调控甲状腺肿瘤干细胞自我更新的分子机制并明确了该通路在甲状腺癌靶向治疗中的作用。