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天然免疫在宿主抵御病原微生物入侵中的作用非常关键。天然免疫RIG-I样受体家族（RLR）在识别病毒感染,诱导宿主干扰素反应,抵御病毒过程中发挥重要作用。RLR家族包括RIG-I、MDA5和LGP2三个成员。RIG-I和MDA5在识别病原相关分子模式（PAMP）后,通过其信号活性域CARDs向下游传递信号,与同样含有CARD结构域的接头分子线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）发生同源相互作用,最终激活转录因子IRF3和NF-κB,促进I型干扰素（IFN）和促炎性细胞因子的表达,并启动干扰素信号级联反应,抵抗病毒的感染。LGP2无信号活性域CARDs,不能向下游传递信号,主要通过调控RIG-I和MDA5活性发挥作用。尽管对人和小鼠RLR有广泛研究,但目前对家畜RLR缺乏系统的研究。本研究分离鉴定了猪RLR家族成员RIG-I、MDA5和LGP2,对其信号功能、相互关系及抗病毒作用进行了系统研究。1、猪RIG-I样受体RIG-I、MDA5和LGP2功能分析及其抗病毒作用研究本研究通过基因克隆,从猪肺泡巨噬细胞（PAM）中分离出了猪RIG-I样受体成员RIG-I、MDA5和LGP2基因,将基因片段连接至pENTR4-MCS中间载体,再通过LR位点特异性重组反应,分别构建出pRIG-I、pMDA5和pLGP2的pcDNA真核表达质粒。经Western-blotting验证,pRIG-I、pMDA5和pLGP2表达的蛋白大小分别为120 kDa、140kDa 和 80kDa。将 pRIG-I、pMDA5 和 pLGP2 分别转染 HEK293T 细胞,发现pRIG-I、pMDA5均有组成性活性,且pMDA5的信号更强,而pLGP2无信号活性。pRIG-I和pMDA5对不同的双链RNA（dsRNA）和病毒刺激有相似的应答信号活性。CRISPR/Cas9方法制备三种猪RLR敲低的PAM和PK15细胞。在pRIG-I和pMDA5敲低PAM和PK15细胞中,与对照细胞相比,dsRNA类似物低分子量poly I:C刺激和病毒VSV、EMCV感染后诱导表达下游基因IFNp、ISG56、ISG60和IL8的转录水平均显著降低。pLGP2虽然无信号活性,但在pLGP2敲低PAM和PK15细胞中,感染或刺激诱导下游基因的转录水平也降低。为进一步确认猪RLR的功能,分别构建pRIG-/-、pMDA5-/-和pLGP2-/-PAM细胞。上述细胞中,低分子量或高分子量polyI:C刺激诱导的IFNβ、ISG56、IL1β、IL8和TNFα的转录水平均显著降低;病毒VSV、EMCV、SeV、H9N2、HSV1复制和基因表达均增加,而病毒诱导下游细胞因子IFNβ、ISG56、IL1β、IL8和TNFα基因的转录水平显著降低;此外,EMCV感染刺激下游转录因子IRF3磷酸化水平和ISG56蛋白表达也显著下调。这些结果表明:ⅰ pRIG-I和pMDA5能感受识别不同RNA和病毒并激活相似细胞信号,与人和小鼠RIG-I/MDA5的选择性识别不同;ⅱ pRIG-I、pMDA5和pLGP2可能都有广谱的抗病毒功能;ⅲ pLGP2可能对pRIG-I和pMDA5信号有相似的调控作用。分别在PAM和Marc-145细胞中过表达pRIG-I、pMDA5和pLGP2,结果表明猪流感病毒H9N2、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒（JXA1-R株）在三种RLR过表达细胞中的复制与蛋白表达受到显著抑制。pRIG-I和pLGP2在IPEC-J2细胞中过表达也能抑制猪流行性腹泻病毒（YC2014株）的复制。这些结果表明,猪的RIG-I样受体具有广泛抗病毒效应,在抵抗猪流行性病毒感染中发挥着重要作用。2、猪RIG-I样受体LGP2对RIG-I和MDA5信号的调控作用研究猪的LGP2没有信号活性,但我们发现,在pLGP2转染的PAM细胞中,低分子量poly I:C刺激或VSV病毒感染诱导下游基因IFNβ、ISG60、IL8以及TNFα的转录水平升高,且呈LGP2剂量依赖性,表明pLGP2对pRIG-I/pMDA5信号具有正调控作用。pLGP2敲低细胞（PAM和PK15）以及pLGP2-/-PAM中RNA刺激和病毒感染诱导下游基因表达降低也提示pLGP2对pRIG-I/pMDA5信号的正调控作用。为解析pLGP2对pRIG-I和pMDA5信号的单独调控作用,将pLGP2分别转染pRIG-/-和pMDA5-/-PAM细胞,结果显示病毒VSV感染诱导下游IFNβ和ISG56基因转录水平都升高,证明pLGP2对pRIG-I和pMDA5信号均具有相似的正调控作用。机制层面,激光共聚焦显微镜观察和免疫共沉淀试验结果显示,pLGP2在细胞激活后可以与pRIG-I和pMDA5发生相互作用。通过原核表达与蛋白纯化,我们获得了pRIG-I、pMDA5和pLGP2纯化蛋白;体外RNA结合试验结果显示,pLGP2能够促进pRIG-I 和 pMDA5 与 RNA 配体 poly I:C 的结合。为探究 pLGP2 对 pRIG-I 和 pMDA5调控的活性位点,我们构建了猪LGP2结构域及其缺失体,ATP酶和dsRNA结合缺陷的点突变体。有趣的是,我们发现大部分猪LGP2突变体均表现出组成性活性,尤其是ATP酶活性位点突变体MIIa和MIII以及结构域L1、L2组成性活性尤其明显。激光共聚焦显微镜观察结果显示,点突变体MIIa和结构域L1、L2还表现出明显的核定位现象。所有pLGP2突变体在pRIG-/-和pMDA5-/-PAM转染表达,与对照PAM相比,pLGP2突变体组成性活性有不同程度下降,提示pLGP2突变体组成性活性可能与RIG-I和MDA5信号有关。pLGP2全长和MIII点突变体回补pLGP2-/-PAM细胞均可以拯救抗病毒作用和病毒诱导下游IFNp和ISG56转录水平。3、猪RIG-I和MDA5信号结构域CARDs的信号活性及抗病毒功能研究虽然RIG-I和MDA5有类似的分子结构,但它们的激活机制稍有不同。猪RIG-I和MDA5N端信号活性域串联CARD（CARDs）的氨基酸同源率非常低,不到20%。因此我们想知道猪RIG-I和MDA5的CARDs在信号活化和抗病毒功能方面是否有差异。我们分离表达了猪RIG-I和MDA5的CARDs,其蛋白分子量在30 kDa左右,且MDA5的CARDs明显比RIG-I的CARDs分子量大。由于二者的CARDs均为200氨基酸,所以猪RIG-I和MDA5的CARDs可能存在不同的翻译后修饰。分别将猪RIG-I和MDA5的CARDs转染PAM细胞发现,猪RIG-I和MDA5的CARDs均有组成性活性,且比相应全长组成性活性更强。激光共聚焦显微镜观察结果显示,猪RIG-I和MDA5的CARDs均有核定位现象,这可能是其组成性活性更高的一个原因。猪MDA5 CARDs信号活性显著高于猪RIG-I CARDs,这与猪全长MDA5的信号活性高于RIG-I结果相一致。在抗病毒试验中,猪RIG-I和MDA5的CARDs表现出了相似的广谱抗病毒活性,不仅能显著抑制VSV、EMCV、SeV和流感病毒H9N2、H1N1系列RNA病毒的复制,还能抵抗HSV1 DNA病毒的感染。转录组测序分析表明pMDA5 CARDs在调节下游差异表达基因方面比pRIG-I CARDs表现出更高活性。PAM细胞过表达pMDA5 CARDs,诱导下游有511个上调和240个下调基因,而pRIG-I CARDs仅诱导了 266个上调和33个下调基因。这一结果与pMDA5 CARDs具有更高的信号活性相一致。但在H9N2病毒感染时,两种CARDs诱导相似数量的上调和下调差异表达基因,与两者相似抗病毒作用一致。这些结果表明,猪RIG-I和MDA5的CARDs在信号活性与抗病毒功能方面既有不同,也有相似。