论文部分内容阅读
结直肠癌是世界上最为常见的致命性消化系统恶性肿瘤之一,已对人类健康构成严重威胁。根据目前研究一致认为,肿瘤的发生和发展不是单分子事件,而是多个因素相互作用的病理过程,并且该过程极其复杂和多变。如人口的老龄化,遗传因素、危险因素的增加（如肥胖、吸烟、饮酒）以及不利的饮食习惯与结直肠癌的发生和发展密切相关。近年来,随着经济飞速发展,人民生活水平不断提高,与几十年前的饮食结构相比,现在有了较多改变,肿瘤的发病率和死亡率也正在逐年升高,患病人群也趋于年轻化。因此,有效的抗肿瘤药物治疗,对于延缓结直肠癌患者的病情,提高其生存率有重要意义。但由于传统化疗药物毒副作用大、耐受性差,而未能取得预期效果。鬼臼苦素（picropodophyllin,PPP）是从我国药用植物小檗科鬼臼中,分离纯化得到的具有天然活性的物质。已有研究表明,鬼臼苦素对卵巢癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤等多种肿瘤细胞增殖有显著抑制作用。但鬼臼苦素在结直肠癌治疗中的作用尚未见报道。本次实验以人结直肠癌HCT-15细胞为研究对象,欲探索PPP对结直肠癌细胞增殖和细胞周期的影响,并进一步分析PPP发挥抗肿瘤作用是否与调控胰岛素样生长因子-I（IGF-I）信号通路有关,为更好地治疗结直肠癌提供理论依据。第一部分鬼臼苦素对人结直肠癌HCT-15细胞增殖及细胞周期的影响目的:本研究以人结直肠癌HCT-15细胞为实验对象,初步探讨PPP对结直肠癌HCT-15细胞增殖、细胞周期的影响及其可能的作用机制。方法:1.用不同浓度的PPP处理结直肠癌HCT-15细胞24h、48h、72h,采用CCK-8法检测HCT-15细胞的增殖活性。2.用不同浓度的PPP处理结直肠癌HCT-15细胞48h,倒置显微镜下观察HCT-15细胞形态及数量的变化。3.用不同浓度的PPP处理结直肠癌HCT-15细胞48h,流式细胞术检测HCT-15细胞周期的改变。4.用不同浓度的PPP处理结直肠癌HCT-15细胞48h,Western Blot检测增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的蛋白表达水平。5.实验数据使用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果:1.CCK-8法结果显示PPP能显著抑制HCT-15细胞的增殖活性,并呈剂量-时间依赖性。2.倒置显微镜下观察发现,细胞失去原有形态回缩为圆形、折光性降低、贴壁生长细胞数量明显减少。3.流式细胞术结果显示,G2/M期细胞比例显著升高,G0/G1期和S期细胞比例明显降低。4.Western Blot结果显示,PCNA、CyclinD1的蛋白表达水平明显降低。结论:PPP可显著地抑制人结直肠癌HCT-15细胞的增殖,提示其作用机制可能是通过下调PCNA、CyclinD1的蛋白表达水平,进而使细胞在G2/M期被阻断以发挥抗肿瘤作用。第二部分鬼臼苦素抑制人结直肠癌HCT-15细胞生长与IGF-I信号通路关系的研究目的:根据第一部分实验结果,进一步分析PPP对人结直肠癌HCT-15细胞发挥抑制作用是否与调控IGF-I信号通路有关。方法:1.对照组、IGF-I组、PPP组、（IGF-I+PPP）组分别处理HCT-15细胞48h,采用CCK-8法检测细胞的增殖活性。2.对照组、IGF-I组、PPP组、（IGF-I+PPP）组分别处理HCT-15细胞48h,在倒置显微镜下,观察比较4组细胞的一般形态。3.对照组、IGF-I组、PPP组、（IGF-I+PPP）组分别处理HCT-15细胞48h,采用Western Blot检测细胞胰岛素样生长因子-I受体（IGF-IR）、磷酸化胰岛素样生长因子-I受体（pIGF-IR）的蛋白表达水平。4.实验数据使用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果:1.CCK-8结果显示,与对照组比较,IGF-I组细胞存活率显著增高;PPP组及（IGF-I+PPP）组细胞存活率明显降低;PPP组与（IGF-I+PPP）组对细胞存活率的影响无差异。2.在倒置显微镜下观察发现,对照组细胞贴壁良好;IGF-I组细胞密集贴壁生长并且细胞数量最多;PPP组及（IGF-I+PPP）组细胞生长严重受限,表现为部分细胞回缩甚或破裂的异常细胞形态。3.Western Blot结果显示,与对照组比较,IGF-I组显著上调pIGF-IR的蛋白表达;PPP组及（IGF-I+PPP）组均可下调pIGF-IR的蛋白表达且PPP组与（IGF-I+PPP）组对此无差别;4组间细胞IGF-IR蛋白的表达均无差异。结论:PPP可拮抗IGF-I的促细胞增殖,并可在蛋白分子水平降低IGF-I引起的pIGF-IR高表达,说明PPP可阻断IGF-I引起的信号通路,从而发挥抑制作用。