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酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)系指长期过量饮酒导致的肝脏疾病。通常初期表现为脂肪肝，继续进展成为酒精性肝炎(alcoholichepatitis, AH)、酒精性肝纤维化(alcoholic hepatic fibrosis, AHF)和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis,AC)。该病在西方国家发病率高，在国内其发病率随着酒精消耗量增加，嗜酒人群扩大，亦逐年上升，已经成为肝损害的重要病因。ALD的致病因素是明确的，单一的，然而目前其发病机制尚不明确，可能涉及氧化应激、脂质过氧化、线粒体损伤、金属离子代谢紊乱、遗传、营养以及免疫学机制等诸多方面。由于啮齿类动物天生厌酒，建立符合人类饮酒习惯的ALD模型相对困难，尤其是单纯的酒精刺激很难形成纤维化。因此建立良好的ALD的模型，探讨其发病机制是当前研究的重点。肝脏不仅是一个代谢器官，而且是一免疫器官，包括天然免疫系统和适应性免疫系统，这两大系统能精确调控内源性和外源性抗原免疫反应，既能避免反应过度导致自身免疫性疾病，又能防止有害病菌的入侵和感染。其中CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是诱导和维持抗原特异性T细胞耐受、防止自身反应性免疫应答的关键。CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg系一群不同于Th1、Th2和Th17的具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，具有很强的免疫抑制能力，可通过抑制效应性T细胞的活化和增殖来调节外来抗原或自身抗原的免疫应答，维持机体免疫稳态。CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg数量及功能的异常是多种自身免疫性疾病的重要的发病机制，同时亦在多种肝病的发病中起重要作用。但是迄今为止尚无CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg与ALD的相关性研究。探讨CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg在ALD中的作用机制为进一步从免疫角度指导治疗提供理论依据。目的：1建立急、慢性ALD动物模型。2研究CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg与小鼠急、慢性ALD的关系。方法：本实验采取随机-对照的研究方法。实验分为慢性组及急性组两部分，将SPF级雄性C57BL/6小鼠按照随机数字表随机分组。(1)①慢性组C57BL/6小鼠40只，自由饮服Lieber-DeCarli酒精液体对照饲料5天后，分为Control+CCL4组、Control+olive oil组、Alcohol+CCL4组、Alcohol+olive oil组各10只，分别予Lieber-DeCarli酒精液体饲料及其对照饲料自由饮服8周；第9周开始予Control+CCL4组和Alcohol+CCL4组小鼠2.5%CCL44mL/kg腹腔注射，2次/周，同时予Control+olive oil组和Alcohol+olive oil组小鼠橄榄油4mL/kg腹腔注射，2次/周；第10周处死小鼠；②慢性组的研究显示在酒精性脂肪肝和纤维化组中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg变化趋势一致，为了研究急性ALD中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的变化，故设计了急性组，进行相关性研究。C57BL/6小鼠20只，分为Control组、Alcohol组各10只，同样的方法引入Lieber-DeCarli酒精液体饲料及对照饲料，自由饮服10天，第11天分别给予酒精或麦芽糖5g/kg灌胃，10小时后处死小鼠。(2)每天观察小鼠精神状态，毛发光泽度，进食、行为情况等，每天记录进食量，每周测量小鼠体重。(3)观察各组小鼠肝脏组织大体形态变化，记录肝脏重量，计算比较肝重指数变化。(4)应用苏木素伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色和苦味酸-天狼猩红染色观察肝脏病理组织学改变。(5)检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)等变化。(6)分离肝脏及脾脏淋巴细胞，应用流式细胞术(fluorescence activated cell sorting, FACS)检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的比例。(7)采用实时荧光定量PCR(Real-timefluorescent quantitation PCR, Real-time qPCR)方法检测各组小鼠肝脏Foxp3mRNA、IL-2mRNA和TGF-β mRNA的相对表达量。结果：(1)①慢性组：Control+olive oil和Control+CCL4组肝脏大小、质地正常。Alcohol+olive oil组小鼠肝脏外形饱满，颜色黄，表面纹理粗糙，切面油腻、脆。Alcohol+CCL4组上述变化更显著。Alcohol+olive oil和Alcohol+CCL4组的肝重指数较Control+olive oil和Control＋CCL4组增加，以Alcohol+CCL4组升高最为明显，达6.33±0.47；Control+olive oil组与Alcohol+CCL4和Alcohol+olive oil组比较，P<0.05；②急性组：Control组肝脏大小、质地正常。Alcohol组外形饱满，色稍黄，切面不清晰；其肝重指数与Control组比较(4.50±0.90vs4.99±0.08, P<0.05)。(2)肝脏组织病理学观察，①慢性组：Control+olive oil和Control+CCL4组肝细胞大小及排列正常； Alcohol+olive oil组中央静脉和小叶间静脉周围出现肝细胞肿胀、胞质疏松、水样变等改变，可见小或中等空泡样改变，胞核被挤向一边，少量淋巴细胞浸润；Alcohol+CCL4组上述变化更加显著，可见大量小或中等空泡样改变，胞核被挤向一边，可见片状肝细胞坏死，大量淋巴细胞浸润；在肝汇管区的动静脉及肝窦内偶可见到血液瘀滞。苦味酸-天狼猩红染色显示：Alcohol+CCL4组可见肝小叶紊乱，在中央静脉周围及汇管区可见纤维沉积增多，肝纤维化形成，而其他组只见小叶静脉管壁纤维组织染色。胶原阳性染色区域定量显示：Alcohol+CCL4组高于Alcohol+olive oil、Control+CCL4及Control+olive oil组(0.03±0.00vs0.01±0.01,0.01±0.01,0.01±0.01, P<0.05)；②急性组：Alcohol+olive oil组中央静脉周围出现少许肝细胞肿胀、胞质疏松，水样变等改变，可见小或中等空泡样改变，胞核被挤向一边。(3)①慢性组ALT、AST和TG在各组中分别为Control+CCL4组34.76±3.90U/L、111.57±5.90U/L、0.59±0.06mmol/L，Control+olive oil组31.90±1.93U/L、99.61±4.88U/L、0.54±0.04mmol/L，Alcohol+CCL4组124.82±9.94U/L、205.18±14.86U/L、0.88±0.06mmol/L，Alcohol+olive oil组195.11±3.64U/L、201.12±6.81U/L、0.76±0.06mmol/L；ALT、AST、TG在Alcohol+CCL4和Alcohol+oliveoil组中均显著增高，与Control+CCL4和Control+olive oil组比较，P<0.05；而Alcohol+CCL4组与Alcohol+olive oil组之间比较，P>0.05；②急性组ALT、AST和TG在Control组为31.14±2.26U/L、112.23±10.23U/L和0.52±0.06mmol/L，Alcohol组95.58±10.52U/L、220.40±13.41U/L和0.86±0.05mmol/L；ALT、AST、TG在Alcohol组均显著增高，与Control组比较，P<0.05；(4)慢性组肝脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg比例在Control+CCL4、Control+olive oil、Alcohol+CCL4及Alcohol+olive oil组分别为6.45±1.17、4.78±0.84、12.35±0.82和10.21±1.61；Alcohol+CCL4和Alcohol+olive oil组较Control+CCL4和Control+olive oil组增高，且P<0.05；而Alcohol+CCL4和Alcohol+olive oil组之间以及Control+CCL4和Control+olive oil组之间比较，P>0.05。在脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg比例各组间比较，P>0.05。(5)Real-time qPCR实验结果：①慢性组肝脏组织中Foxp3mRNA相对表达量在Control+CCL4、Control+olive oil、Alcohol+CCL4及Alcohol+olive oil组分别为1.25±0.16、0.95±0.07、3.17±0.77和2.91±0.28； Alcohol+CCL4和Alcohol+olive oil组较Control+CCL4和Control+olive oil组增高，且P<0.05；而Alcohol+CCL4组与Alcohol+olive oil组之间以及Control+CCL4组与Control+olive oil组之间比较，P>0.05。TGF-β mRNA相对表达量在Control+CCL4、Control+olive oil、Alcohol+CCL4及Alcohol+olive oil组分别为1.81±0.57、1.49±0.23、2.99±0.30和1.78±0.15；Alcohol+CCL4组与其他组比较增高，P<0.05；Alcohol+olive oil组与Control+CCL4和Control+olive oil组比较及Control+CCL4组与Control+olive oil组比较，P>0.05。IL-2mRNA相对表达量在Control+CCL4、Control+olive oil、Alcohol+CCL4及Alcohol+olive oil组分别为1.00±0.11、0.70±0.25、2.61±0.70和2.21±0.26；Alcohol+CCL4较其他组增高，且P<0.05；Alcohol+olive oil组与Control+olive oil组比较，P<0.05；Control+CCL4组与Control+olive oil组之间比较，P>0.05；②急性组肝脏组织中Foxp3mRNA相对表达量在Control组与Alcohol组比较(4.93±0.32vs5.07±0.17, P>0.05)。TGF-βmRNA相对表达量在Control组与Alcohol组比较(2.83±1.24vs7.80±0.66,P<0.05)。IL-2mRNA相对表达量在Control组与Alcohol组(0.10±0.00vs0.08±0.21, P>0.05)。结论：1成功建立了急、慢性ALD小鼠模型。2在慢性ALD小鼠无论是肝内淋巴细胞的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg百分比，还是肝脏组织的Foxp3mRNA都是升高的，CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg可能与慢性ALD发病有关。然而在急性ALD肝脏组织中Foxp3mRNA却变化不显著，可进一步从细胞学角度研究。