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目的:禽网状内皮组织增生症是由禽网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的鸡、鸭、火鸡及其他禽类的一群病理综合征。REV属反转录病毒,感染后可导致禽类生长迟缓、形成慢性肿瘤等,还可损伤禽类免疫器官,造成机体免疫功能下降,从而导致免疫失败,极易继发感染其他疾病。REV所引起的网状内皮增生症在英国、德国、澳大利亚等均有报道,该病在我国的流行呈逐渐扩大趋势,我国家禽感染REV已达20%-30%。给养禽业带来的损失越来越严重。REV的基因组结构为单链线性RNA,含有gag、pol、env基因,env基因编码的是gp90蛋白和gp20蛋白,gp90蛋白属于REV囊膜蛋白,是REV的免疫原性蛋白,可诱导机体产生中和抗体,在机体的免疫应答中发挥着重要作用。因此,体外获得gp90蛋白,研究其免疫学特性,对探索REV的致病机制及该病的预防、诊断具有重要意义。方法:本试验通过选择p ET-22b(+)及p ET-30a(+)两种载体,针对gp90全基因设计引物,并在两端添加Eco R I和Xho I限制性内切酶,以p MD-19T-gp90重组菌基因组为模板,扩增gp90基因。将目的基因与载体p ET-22b(+)及p ET-30a(+)同时进行Eco R I和Xho I双酶切,经纯化回收后,将目的基因克隆至p ET-22b(+)及p ET-30a(+)载体上,构建重组载体p ET-22b(+)-gp90及p ET-30a(+)-gp90,然后分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,对PCR鉴定及双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行核苷酸序列测序。对测序结果运用blast软件进行比对分析,观察有无基因突变。将p ET-22b(+)-gp90及p ET-30a(+)-gp90重组阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,使用PCR法及双酶切法鉴定阳性重组质粒,鉴定无误后再次进行核苷酸序列测序,对测序结果进行分析,再次检查基因序列是否与原序列一致。采用IPTG对重组菌进行诱导表达,使用SDS-PAGE法及western-blot法鉴定目的蛋白表达情况及表达形式、反应原性。对目的蛋白进行纯化,制备鸡抗gp90血清,将免疫的鸡分别在21、28、35、42天采血收集血清,ELISA检测其抗体效价。鸡免疫42天时处死,制备脾脏淋巴细胞,检测gp90抗原体外刺激后分泌的细胞因子水平(IFN-γ、IL-4),分析细胞免疫应答。结果:1.成功扩增gp90基因并构建重组克隆载体p ET-22b(+)-gp90及p ET-30a(+)-gp90,经IPTG诱导,当温度为37℃,IPTG浓度为1m M时,E.coli BL21-p ET-22b(+)-gp90及E.coli BL21-p ET-30a(+)-gp90有目的蛋白表达,且大小与预期的一致,而当30℃时无目的蛋白表达;Western-blot法检测表明目的蛋白以包涵体形式表达。2.对目的蛋白进行纯化,结果表明,gp90重组蛋白能较好的被纯化出来。且纯化后的目的蛋白纯度达到95%以上;ELISA方法检测gp90抗血清的效价为12500EU。且gp90抗血清在免疫的第42d抗体效价达到最高。3.细胞因子检测结果显示,gp90刺激产生IFN-γ、IL-4的浓度分别为114.56pg/m L、68.76 pg/m L,均明显高于PBS阴性对照组,表明gp90能够刺激鸡产生较高水平的IFN-γ和IL-4,说明gp90蛋白免疫鸡后能够同时刺激鸡产生Th1和Th2型的细胞免疫应答。结论:gp90蛋白成功克隆表达,具有良好的免疫原性和反应原性;gp90蛋白能够引起鸡产生Th1和Th2型的免疫反应。