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钙信号在细胞的许多生理进程中都起着重要作用,保持胞内钙离子的平衡对细胞来说至关重要,而胞内钙平衡是由一些钙泵、钙离子交换体、钙离子通道、酶等共同参与调控的。瞬时受体电位通道蛋白超家族(Transient receptor potential superfamily,TRP superfamily)就是一类重要的离子通道,并且大部分TRP蛋白对Ca2+具有良好的通透性。在哺乳动物、果蝇、线虫中的研究结果表明TRP蛋白在“感觉生理”,如视觉、味觉、嗅觉、触觉、听觉中发挥了重要作用。在真菌中研究最多的TRP蛋白Yvc1在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白念珠菌(Candidaalbicans)中参与调控了细胞在逆境下的生长,同时参与了逆境刺激下胞内Ca2+浓度的调控。在条件致病菌C.albicans和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中,Yvc1及其在A.fumigatu 中的同源蛋白AfYvcA还参与了真菌毒力的形成,与S.cerevisiae和C.albicans中不同,AfYvcA对烟曲霉在多种逆境下的生长发育并没有明显影响。本文以模式真菌构巢曲霉(Asperglllus nidulans)为研究对象,根据酵母中的TRP蛋白信息进行了比对分析,发现在A.nidu ans中存在4个假定的TRP蛋白,分别是由S.cerevisiae中的Yvc1比对而来的YvcA和TrpA以及由裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TRP 蛋白 Trp1322 和 Pkd2 比对而来的TrpR和Pkd2A。生物信息学分析显示它们具有部分TRP蛋白的特点,包括多跨膜区、TRP domain及跨膜区间的相似性。根据比对分析的结果,本课题对YvcA、TrpA、TrpR进行了后续研究。对YvcA的研究结果表明,和烟曲霉一样,将yvcA敲除以后并未影响菌株在多种逆境下的产孢和极性生长,同时对胞质内钙离子浓度也没有显著影响。另一个由S.cYvc1比对而来的TrpA同样在菌株生长和胞质内钙流调节上也没有明显功能,并且这两个蛋白也没有在功能上互偿。对TrpR的研究中首先发现了 TrpR参与A.nidulans对温度的感受,当敲除trpR后,菌株会对高温变得敏感,表现为产孢相对野生型显著减少。当在培养基中特异性地添加Ca2+则可以恢复敲除菌在高温下的敏感表型。此外,△trpR会对低钙环境变得敏感,同时在高钙刺激下△trpR的钙流峰值会高于野生型,这三个结果表明trpR的功能可能与Ca2+浓度调节有关。研究中还发现△trpR对细胞壁破坏试剂刚果红(CongoRed,CR)和卡泊芬净(Caspofingin)敏感,说明trpR还可能参与了细胞壁的合成。进一步研究发现,trpR与多个钙信号通路中的基因在产孢及应对细胞壁压力上具有共同调控的作用。具体来说,trpR与编码细胞质膜上高亲和性钙离子通道蛋白的两个基因midA和cchA对产孢具有协同调控的作用;在△cchA基础上敲除trpR可以恢复由于cch4缺失导致的高钙刺激下钙流峰值的降低;在细胞壁压力测试中,△trpR△midA和△trpR△cchA对CR的敏感度处于两个亲本菌株之间。trpR与编码高尔基体膜上的钙离子通道基因pmrA在产孢上也有十分显著的协同调控作用,并且外源添加钙离子几乎不能恢复双基因敲除菌的产孢。trpR与编码内质网上钙连接蛋白的基因clxA对产孢也有一定的协同调控,但外源添加钙离子能够一定程度恢复双基因敲除菌的产孢。trpR与编码钙调磷酸酶催化亚基的基因cnaA双敲除以后与△cnaA表型类似,但外源添加钙离子能一定程度恢复△cnaA的产孢而对双基因敲除菌的产孢恢复十分有限。trpR分别与clxA,pmrA,cnaA的双基因敲除菌均呈现出在细胞壁压力CR上比亲本菌株更敏感,尤其是△trpR△pmrd。以上结果表明trpR参与了多种逆境的响应,包括高温、细胞壁压力、低钙环境,并且该基因与钙信号通路中的多个组分对产孢及细胞壁压力响应具有共同调控的作用。此外,trpR与cchA反向调控了高钙刺激下胞质内钙流的变化。