研究背景：创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是神经外科常见急症之一,也是儿童和青壮年死亡和致残的重要原因,尤其是中、重型颅脑外伤对患者的生存时间、神经功能的影响巨大,且TBI后常常会伴发其他系统的功能障碍,严重时甚至可导致并发全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),给社会和家庭带来严重的医疗和经济负担。尽管近十年来,颅脑外伤的基础和临床研究取得了很大的进步,新的理论不断产生和发展,但是目前仍然没有明显有效的治疗措施能减少死亡率和致残率。TBI后的病理生理过程至今仍然不完全清楚,目前已知的是TBI后脑的损伤可分为两个阶段,即初始损伤阶段和继发性损伤阶段。初始阶段是指损伤本身,由直接的头颅撞击或者加速性、减速性损伤引起的；第二阶段则从损伤开始持续到接下来的几天或者几个星期,为了修复损伤组织的内稳态,这个迟发的阶段将进行一系列的生理学、细胞及分子层面的反应。第二阶段如果没有得到良好的控制,则会导致继发性损伤。TBI后,原发性损伤将触发一系列病理级联过程,包括激活炎症反应、产生氧自由基、释放兴奋毒性神经递质、激活细胞内各种酶。这些可导致细胞的结构破坏和激活细胞凋亡途径。炎症反应在TBI后的继发性脑损伤中具有重要的地位,而核因子-kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)作为核转录因子,已被证明在TBI后对炎症反应的调控中具有重要的作用,其主要参与对其下游的炎症因子、趋化因子、急性期蛋白、促细胞凋亡/抗凋亡蛋白等基因转录的调控。目前已知有多条信号通路参与了对NF-κB结合活性的调控,其中Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)/髓样分化初级反应蛋白88(myeloid differentiation primary response protein88, Myd88)/NF-κB信号通路就是其中比较重要的一种。作为TLRs信号通路的关键性连接蛋白,Myd88主要参与对NF-κB DNA结合活性的调控。抑制Myd88之后,可以明显减少NF-κB的结合活性,NF-κB DNA结合活性受抑制后可以明显抑制下游的炎症因子的表达。TBI后各种炎症因子如白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-a, TNF-α)、细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule1, ICAM-1)等明显升高且呈持续高表达,可以促进循环中的炎症细胞如多形核嗜中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)向脑组织中募集和浸润,TBI后PMNs在脑组织中的浸润已经被大量的基础和临床所证实。浸润的PMNs释放出大量氧化自由基、细胞因子、趋化因子和细胞外基质降解蛋白酶,其中细胞外基质降解蛋白酶包括中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、蛋白酶3(proteinase3, PR3)、组织蛋白酶G (cathepsin G, CG)。具有多种生物活性的NE异常和过量释放进入组织后可直接导致急性炎症进展和(或)慢性炎症疾病。NE属于糜蛋白酶超家族,在中枢神经系统中,PMNs释放的弹性蛋白酶在脑损伤中具有多种作用,包括破坏血脑屏障(blood-brain barrier, BBB),引起血管源性脑水肿；促进炎症细胞向脑血管、实质浸润；诱导细胞凋亡等。但有关NE发挥这些作用的具体机制,目前并不十分清楚。因而通过对NE在TBI后对脑损伤的所起作用的研究可以进一步明确继发性脑损伤的发生、发展的过程。同时NE特异性抑制剂,ONO-5046在多种中枢神经系统损伤模型中均被证实具有一定的保护作用,了解NE在脑损伤中的作用机制也可以为临床新药的开发提供相关的理论依据。目的：通过观察NE特异性抑制剂ONO-5046对小鼠创伤性脑损伤后皮层Myd88的表达、NF-κB DAN结合活性、下游炎症因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1的转录的影响以及对PMNs浸润的影响,明确NE对TBI在继发性脑损伤中作用的可能机制。方法：1.分组及模型将54只C57BL/6成年雄性小鼠(25～30g)随机等分成三组：对照组(Control组,n=18)、脑外伤组(TBI组,n=18)、脑外伤+ONO-5046组(TBI+ONO-5046组,n=18)。创伤性脑损伤模型采用改良的小鼠闭合性脑损伤模型(333g圆柱形撞击锤从2.5cm高度沿垂直金属杆自由下落),对照组小鼠仅行头皮切开,不做头颅打击。TBI+ONO-5046组伤后立即给予腹腔注射ONO-5046溶液,根据每只小鼠体重确保ONO-5046的最终注射量分别为50mg/Kg,伤后24h和48h再腹腔注射相同体积的ONO-5046溶液,对照组和TBI组仅给予相当体积的PBS缓冲液。对照组和TBI组伤后1h行NSS评分。致伤后72小时,每组随机取12只小鼠经左心室插管灌注40ml0.01mol/L PBS缓冲液后断头取脑,切取损伤灶周围5mm的脑组织保存于-80℃,其中每组6只小鼠用于western blot和real-time PCR检测,剩余6只用于髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性检测。每组再取6只小鼠经上述同样路径行4%多聚甲醛灌注(约30m1),断头取脑,脱水后石蜡包埋4℃保存备用。2.胞浆蛋白和胞核蛋白提取将创伤灶周边皮层脑组织取出剪碎,加入800μl蛋白裂解液A液,研磨匀浆,冰浴振荡1h。加入NP-4050μ1,轻摇30sec后,13000rpm离心10min,取上清(内含胞浆蛋白),储存于-80℃用于western blot实验。向沉淀中加入细胞裂解液B液200μl,充分混匀,冰浴振荡2h,13000rpm离心10min,取上清(内含胞核蛋白)储存于-80℃用于用于凝胶电泳迁移率实验。然后根据BCA蛋白定量试剂盒提供的方法进行蛋白定量,具体操作步骤严格按照说明书操作。3. Western Blot检测Myd88蛋白表达取胞浆蛋白,按体积比4/1加入loading buffer,95℃水浴5min。选用10%SDS-PAGE凝胶,每孔上样50μg (10μl)。凝胶电泳(浓缩胶120V,分离胶60V)后,转印到PVDF膜上(100V,90min)。甲醇浸泡1min后,5%脱脂奶粉(TBST稀释)室温下封闭2h,加入兔抗小鼠Myd88多克隆抗体(1/1000)、兔抗小鼠β-actin单克隆抗体(1/1000)4℃孵育过夜。洗脱,用山羊抗兔IgG二抗(1/1000)室温孵育2h。使用ECL(1/1)化学发光检测,曝光、显影、定影。4.凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)法检测NF-κB结合活性参照试剂盒内说明书进行操作：取1.75pmol/μl未标记的双链NF-κB寡核苷酸探针(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’)和T4多核苷酸激酶,用[γ-32P]ATP进行标记,总反应体积为14μl(其中核蛋白40μg,[γ-32P]ATP标记的NF-κB探针2μl, loading buffer2μl,4μl缓冲液,余为自由水),混匀后室温放置10min,预电泳(250V)10min。上样于聚丙烯酰胺凝胶样品孔中,恒压350V电泳90min。电泳结束后轻轻揭下凝胶,烤箱烘干2h,放人暗盒中-80℃曝光、显影,采用Image J图像分析软件测量显色阳性区的平均灰度值。5.实时PCR (real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)检测Myd88、TNF-α、IL-1β、ICAM-1mRNA表达水平按每50～100mg脑组织加1ml Trizol试剂进行组织匀浆,在去RNA酶环境下提取总RNA后,用核酸测定仪检测RNA浓度(OD260/280比值),提取的RNA经反转录仪逆转录成cDNA, Real-time PCR20μl反应体系(2μl cDNA,0.4μl ROX Reference Dye,10μl SYBR Green I,1μl引物,余为DDH2O),95℃30sec变性,反应条件：变性95℃,5sec;退火62℃,34sec,40个循环。读取CT值,与β-actin对比后求出目的RNA的△CT值。6.免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测Myd88在伤侧脑皮层中的表达4%多聚甲醛溶液浸泡的脑组织,以损伤灶为中心,常规石蜡包埋后进行连续切片,切片厚度4μm,脱蜡,水化,抗原修复后,正常动物非免疫血清封闭。加入兔抗小鼠Myd88一抗4℃孵育过夜(一抗稀释比例1/100),洗片后加入1.6%H2O2封闭10min,再加入HRP标记二抗室温下孵育60min后,DAB显色。每张切片随机选取6个高倍视野(×400)观察阳性细胞个数,求平均值后统计学分析。7.伤侧脑皮层中MPO活性检测称取100mg损伤灶周围脑组织,严格按照试剂说明书进行组织匀浆准备,取0.1ml组织匀浆加入试剂三0.9ml混匀后37℃水浴15min。设置对照管和测定管,其中对照管中加入蒸馏水3ml、匀浆样本0.2ml、试剂四0.2ml,测定管中加入匀浆样本0.2ml、试剂四0.2ml、显色剂3ml。充分混匀后,放置37℃水浴30min,再向上述两管中各加入试剂七0.05ml,试剂添加完成后再次混匀,放置60℃水浴10min,取出后立即在全光谱分光光度计,中心波长调至460nm处,测各管吸光度。8.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析。定量资料结果以例数、均数±标准差(x±s)表示。仅对两独立组均数进行比较时,方差齐性采用成组t检验,若方差不齐采用Satterthwaiter校正t检验。多组均数之间比较采用单因素方差分析,差异具有统计学意义时进行两两组间多重比较,若方差齐性,采用LSD检验,若方差不齐用Dunnett’s T3检验。以P≤0.05认为差异有统计学意义。结果：1.大体观察和与NSS评分：试验中所有54只C57BL/6雄性小鼠均来自同一批次,各组小鼠体重无显著差异。外伤模型制作和给药过程中,操作步骤—致。其中TBI和治疗组均无死亡,外伤组和治疗组NSS评分结果无显著差异。2.脑组织Myd88mRNA表达的变化：实时荧光定量PCR结果显示各组间的mRNA表达水平方差不齐(P=0.016),组间的差异显著,具有统计学意义(Welch=185.905,P=0.000),其中,TBI后挫伤灶周围脑组织中Myd88mRNA表达较对照组显著升高(P<0.05),在给予ONO-5046治疗的TBI+ONO-5046组,Myd88mRNA表达水平相对于TBI组显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.脑组织Myd88蛋白表达的变化：Western Blot结果显示各组的相对灰度值方差齐性(P=0.459),组间的差异具有统计学意义(F=53.276,P=0.000)。其中,TBI后挫伤灶周围脑组织中Myd88蛋白含量较显著升高,同PCR结果一样,在TBI+ONO-5046组相较于TBI组Myd88蛋白含量显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.免疫组织化学显示Myd88在脑组织中的变化：IHC结果显示各组间的Myd88阳性细胞计数结果方差齐性(P=0.112),组间的差异具有统计学意义(F=67.152,P=0.000),其中,Myd88在正常小鼠脑组织中也具有一定的表达(10.00±2.23/单个视野),TBI后Myd88这种表达明显升高,相对于对照组阳性细胞显著增多(38.83±3.77/单个视野)(P<0.05), TBI+ONO-5046组阳性细胞相较于TBI组显著降低(25.33±6.15/单个视野)(P<0.05)。5.脑组织NF-κB DNA结合活性的变化：EMSA结果显示各组间的结果方差齐性(P=0.680),组间的差异具有统计学意义(F=65.263,P=0.000), TBI后挫伤灶周围脑组织中NF-κB DNA结合活性较对照组显著升高(P<0.05),在给予ONO-5046治疗的TBI+ONO-5046组,NF-κB DNA结合活性较TBI组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。6.脑组织TNF-α、IL-1β和ICAM-1mRNA表达的变化：PCR结果显示TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA表达水平那个各组间的结果方差均不齐(P值分别为0.002,0.000,0.003),组间的差异具有统计学意义(Welch值分别为342.881,90.368,410.643；P值均为0.000),TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA表达水平在TBI后显著升高,相对于对照组差异具有统计学意义(P<0.05),给予ONO-5046治疗后,相对于TBI组TNF-α、IL-1β和ICAM-1转录水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。7. PMNs浸润水平的变化：MPO活性检测结果显示各组间的结果方差齐性(P=0.148),组间的差异具有统计学意义(F=64.400,P=0.000),其中,TBI组挫伤灶周围脑组织中MPO的活性显著升高,达到1.36±0.22(U/g),而对照组仅0.33±0.14(U/g), TBI+ONO-5046组的结果为0.97±0.09(U/g),差异均具有统计学差异(P<0.05),间接提示TBI后PMNs向脑组织中浸润明显升高,ONO-5046治疗可以明显抑制PMNs向脑组织中的浸润。结论：免疫炎症反应在TBI后继发性脑损伤中具有重要作用。TBI后PMNs大量浸润在多种刺激因素的作用下释放大量的NE,过量的NE释放进入脑组织后可以加剧继发性脑损伤。NF-κB处于炎症反应的核心部位,对TBI后的炎症反应的进展具有重要的作用。Myd88作为NF-κB上游重要的调节因子,对NF-κB结合活性的调节具有重要的作用。在利用ONO-5046特异性抑制NE的活性后能够明显抑制TBI后脑组织中Myd88的表达和NF-κB DNA结合活性,降低下游炎症因子转录、减少PMNs向脑组织中的浸润。ONO-5046能够明显减少TBI后Myd88/NF-κB信号通路的激活、减少PMNs向脑组织中的浸润,表明NE有可能通过激活Myd88/NF-κB信号通路发挥促进炎症反应的作用。