论文部分内容阅读
目的:通过对纳入研究的人员证候表现进行聚类分析,探究膝关节骨关节炎中医证型分布规律,再通过苍膝通痹胶囊、仙灵骨葆胶囊及硫酸氨基葡萄糖在临床中治疗膝关节骨关节炎上的差异进行观察比较,确定苍膝通痹胶囊的临床治疗作用及治疗优势;利用网络药理学和分子对接技术对苍膝通痹胶囊治疗膝关节骨关节炎保护膝关节关节软骨的药物分子作用机制进行系统科学分析,阐释该药物作用于膝关节骨关节炎的分子机制;通过动物体外细胞实验对苍膝通痹胶囊的药效评价和相关机制进行探索。方法:第一部分为临床回顾性研究,根据膝关节骨关节炎的诊疗指南及医院的实际情况制定本项研究所需要的各项标准,搜集2019年9月至2020年8月由我院(山东中医药大学附属医院)收治的140例KL分期I~II期KOA患者,共3组,A组:苍膝通痹胶囊药物组,50人,B组:仙灵骨葆胶囊药物组,48人,C组:硫酸氨基葡萄糖组,三组用药总时长均为2月,确定治疗方法后随机抽取,被抽取的人员病例信息系统中均须有定期随访资料,根据疼痛视觉模拟评分标准、Lequesne指数评分标准及治疗有效率进行效果评定,通过系统类聚法对证型进行分布研究。第二部分为苍膝通痹胶囊相关研究的数据挖掘,通过TCMSP数据库寻找本方剂组方:独活、威灵仙、苍术、鸡血藤、草薛、桑寄生、骨碎补、川牛膝及川断的有效化合物成分,采用药物口服生物利用度、药物相似性、化合物相对分子质量等几项药理学一般核心参数对药物化合物进行评价,构建药物-成分-靶点-疾病网络,探析药物干预靶点后的作用机理,科学的综合分析“君臣佐使”的药物分布规律及原因。再通过分子对接技术进行进一步预测其保护关节软骨治疗骨关节炎的作用机制及与p38MAPK信号通路存在的关系,对多成分、多通路、多靶点的配合治疗进行进一步的分析验证。第三部分为大鼠体外细胞实验,本实验采用1周龄SD大鼠关节软骨细胞,采用甲苯胺蓝染色法对软骨细胞进行鉴定,采用炎性因子试剂IL-1β(10ng/ml)进行炎症造模,建立膝关节骨关节炎软骨细胞模型作为研究对象。选取与p38信号通路相关并且在第二部分数据挖掘预测到的相关靶点进行系列验证,通过Cell Counting Kit-8法观察药物干预后细胞活力筛选药物最佳使用浓度,使用q RT-PCR技术检测软骨细胞中LncRNA HOTAIR表达量、苍膝通痹胶囊干预KOA软骨细胞后LncRNA HOTAIR表达量变化以及苍膝通痹胶囊作用后p38MAPK信号通路下主要靶点基因m RNA的表达情况,通过流式细胞凋亡技术对干预后的软骨细胞凋亡率进行检测并获得其变化,采用ELISA法对KOA相关性密切的炎性因子IL-1β、TNF-α的表达水平进行检测,采用Western Blot法检测各组细胞p38MAPK信号通路相关靶点蛋白的表达水平。结果:第一部分临床研究,1、根据所有资料获得三组药物治疗均取得了满意的疗效,其中治疗2周后A组总有效率较比B组高,差异有统计学意义(P<0.05);治疗期越长二者差异越小,1月、2月后治疗效果无显著统计学意义(P>0.05)。2、被抽取的患者VAS评分、Lequesne指数都有所降低并呈下降趋势,效果较为显著,而各组间的治疗效果比较治疗2周时A组中患者的各项参考评分与B组相较存在差异(P<0.05),A组效果优于B组;治疗1月、2月时三组患者的各项研究指标没有明显差异,无统计学意义(P>0.05)。3、通过临床实验本实验纳入研究的三种药物安全等级均可达到I级,均无异常或不良反应。第二部分苍膝通痹胶囊的相关数据挖掘,独活、威灵仙两味君药、臣药的相对分子质量均高于桑寄生,脂-水分配系数(Alog P)独活最高,且与威灵仙、鸡血藤、桑寄生近似,与其他药物明显不同;通过TCMSP数据库共寻找到相关化合物472个,根据药理学OB、DL等相关参数阈值要求筛选后,共有27个化合物符合要求;进行药物-成分-靶点-疾病网络可视化网络构建,网络共有222个靶点,781条边,27个有效成分及1个疾病名称;分子对接结果显示苍膝通痹胶囊27种化学成分与OA关键炎性因子结合能均较为理想。第三部分膝关节骨关节炎体外细胞实验,通过前期研究以及本次药物浓度筛选CCK-8法筛选药物浓度获得苍膝通痹胶囊在100μg/ml时药物浓度最佳;通过流式细胞凋亡技术发现LncRNA HOTAIR过表达组凋亡率最高,正常组最低,过表达组与模型组相较凋亡率升高(P<0.05),药物及阻断剂干预后模型药物组、过表达药物组凋亡率均发生明显较低(P<0.05)。通过ELISA法检测获得过表达组(W3)与模型组(W2)炎性因子表达水平相比,过表达组的炎性因子水平明显升高。(P<0.05),药物组(W4)、过表达药物组(W5)、阻断剂组(W6)及阻断剂过表达组(W7),这些分别与模型组(W2)、过表达组(W3)相比,KOA相关炎性因子在药物、阻断剂干预后均呈现不同程度的降低,各组间数据进行统计学分析具有差异(P<0.05),而W4组、W5组与W6组、W7组相较无明显差异性(P>0.05);通过q RT-PCR法检测LncRNA HOTAIR表达量,与正常组(L1)相比,1L-1β干预后LncRNA HOTAIR明显升高,再加入1L-1β干预细胞的基础上,转染LncRNA HOTAIR,过表达腺病毒对其进行过表达可较明显的提高LncRNA HOTAIR表达量,统计学分析存在差异并且满足统计学意义(P<0.05),因此说明转染成功;通过q RT-PCR法检测苍膝通痹胶囊干预后LncRNA HOTAIR表达量变化,实验结果显示,与1L-1β组(H2)的LncRNA HOTAIR表达量相比,CX+1L-1β组(H3)与CX+1L-1β的LncRNA HOTAIR过表达组(H4)均有明显降低,P<0.05,具有统计学意义;最后,分别采用q RT-PCR、Western Blot法分别检测苍膝通痹胶囊干预LncRNA HOTAIR/p38MAPK信号通路中相关蛋白和基因的表达,两种方法结果显示均为Collagen II空白组(W1)表达最高,过表达组(W3)表达水平最低,MMP13、P38的表达水平空白组(W1)最低,过表达组最高,统计学分析具有差异并且满足统计学意义(P<0.05);药物组(W4)、过表达药物组(W5)与模型组(W2)、过表达组(W3)表达水平相比,药物组(W4)、过表达药物组(W5)均可降低软骨细胞中MMP13、P38的蛋白基因表达,同时升高Collagen II的蛋白基因表达,统计学数据分析各组间存在差异性并且各种差异满足统计学意义(P<0.05),同时W4组、W5组与W6组、W7组相较无明显差异(P>0.05)。结论:1.苍膝通痹胶囊对膝关节骨关节炎患者具有一定保护关节软骨缓解临床症状的作用,通过临床实验发现该药物的特点为药物显效时间较早、疗效更加可靠,这也是其临床优势所在。2.通过系统数据挖掘发现苍膝通痹胶囊针对膝关节骨关节炎的诊疗涉及多条通路及靶点,并且该方中多味草药所含药物分子对膝关节骨关节炎具有缓解症状减轻痛苦的作用,其针对膝关节骨关节炎的症状缓解及相应治疗具有相对科学性。3.通过本项目大鼠体外细胞实验研究我们初步认为苍膝通痹胶囊可通过靶向调控LncRNA HOTAIR/p38MAPK信号通路达到缓解膝关节骨关节炎患者临床症状保护患者关节软骨的相应作用。