卤虫休眠胚胎形成过程中相关基因分子克隆及功能研究

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卤虫作为一种古老的极端甲壳类生物,它有两套生殖方式。在环境适宜的情况下,成熟个体倾向于通过卵胎生途径直接产出无节幼体;而当生存条件恶化时,则采用卵生途径产下休眠胚胎来延续种群,直至休眠状态被打破。在休眠胚胎的孵化发育过程中,虽然细胞内部发生着巨大的变化,如细胞分化、大分子物质合成、能量代谢、形态发生等,但是其细胞数量始终维持不变。科学家们普遍认为,卤虫休眠胚胎发育过程中细胞分裂与细胞分化、形态发生独立的现象有利于胚胎维持稳定,提高存活能力。但是这一过程的相关分子机制仍然探究极少。本研究主要选取了4个卤虫休眠胚胎发育相关基因——谷氨酰胺酶(Ar-GLS)、类ste20激酶(Ar-SLK)、prohibitin2(Ar-PHB2)和自噬相关基因5(Ar-Atg5)。首先通过简并引物PCR的方法,克隆获得一段特异性序列。再运用RACE技术,获得了Ar-GLS、Ar-SLK、Ar-PHB2的全序列,并对它们的基因表达量进行了分析。在此基础上,我们构建了Ar-GLS的原核表达系统,获得了特异性抗体。我们发现将卤虫休眠胚胎激活孵化过程的谷氨酰胺酶抑制后,其破壳产生的无节幼体卵黄蛋白的降解变缓,AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化活性增高。同时,我们也对Ar-SLK功能进行了研究,发现Ar-SLK RNA干涉后产出的无节幼体高温、强酸、缺氧、强辐射四种胁迫处理发现,其抗环境胁迫的能力明显下降。我们得到的数据为进一步探究卤虫在休眠胚胎发育过程中的分子机制奠定了基础。
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