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自20世纪90年代中期以来H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在中国呈地方流行性,单纯H9N2病毒感染只会引起轻微临床症状,如果继发其他病原则死亡率大大提高。禽流感病毒在陆生禽类中流行并演化成为不同的基因型,目前H9N2病毒在我国家禽中优势流行株是S(G57)基因型,该基因型最早出现在2007年,2010年以后成为优势基因型。H9N2病毒主要自然感染家禽,自1998年以来,其宿主谱不断扩大,中国香港和大陆其他省份陆续的从猪和人的体内分离到Y280谱系的病毒。H9N2 AIV特别是S基因型病毒可以作为包括H5N1,H7N9和H10N8在内的新型人类禽流感病毒的基因供体,通过基因组重配产生能够引起人类严重感染的病毒,严重威胁着公共卫生安全。H9N2病毒在感染不同宿主后在环境和抗体选择压下生物学特性也发生了改变,前期研究表明F98-like H9N2病毒部分毒株具有气溶胶传播特性,但是S基因型病毒的气溶胶传播特性并无相关报道。流行病学调查表明活禽交易市场在多种亚型病毒的转播中起到了非常重要的作用,市场的工作人员和交易人员暴露于感染了禽流感病毒的禽群是人感染禽流感病毒的一个主要途径,其中交易的家禽也是流感病毒的天然病毒库。尽管不同时期H9N2亚型AIV分离株的谱系和基因型已有报道,但H9N2优势流行株的致病性特别是气溶胶传播特性的研究相对较少。对H9N2病毒致病性进化的充分掌握,将有助于我们更好地预防和控制H9N2,防止其他具有潜在威胁的流感病毒在中国各地爆发。本研究的目的是对活禽交易市场禽流感病毒进行流行病学调查,并对华东地区流行的H9N2病毒进行遗传进化分析和致病性分析。1.2014-2016年中国部分地区禽流感病毒流行病学监测2014年12月-2015年11月,我们对江苏地区部分活禽交易市场进行了禽流感的流行病学监测,从76个禽群共900份棉拭子样品中分离到了 42株禽流感病毒,包括H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9和H11共8个HA亚型。流感病毒的总分离率为4.67%,群阳性率为23.7%;其中高致病性H5亚型病毒的分离率最高,为1.1%,占阳性样品总数的23.8%;其次为低致病性H9亚型病毒,分离率为0.67%。H1、H3、H4、H6、H11等低致病性流感病毒的分离率相对较低,且均从水禽中分离到。调查的不同宿主中,禽流感病毒在鸭群的分离率最高,达10.6%;其次是鸡群,为3.25%。结果表明,活禽交易市场中禽流感病毒的分布呈多样性:鸡是H5、H7和H9亚型病毒感染的主要宿主;鸭携带除H7亚型之外的所有亚型禽流感病毒,特别是H3、H4、H6、H11亚型禽流感病毒;H5、H7和H9亚型禽流感病毒主要出现在秋冬季节。因此,活禽交易市场是各种亚型禽流感病毒存在的重要场所,且鸭是禽流感病毒重要的储存宿主;加强对活禽交易市场的监测和管理对于控制禽流感至关重要。2015-2016年临床样品中共分离H9亚型禽流感病毒64株,当前H9亚型在华东地区仍然流行。2.华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株遗传变异分析2014年至2016年期间,从华东地区活禽市场的健康家禽或组织样本的中分离出71株H9N2病毒,所有病毒均具有低致病性禽流感(LPAI)病毒的特征。对部分毒株的HA和NA进行序列测定,遗传进化分析表明,这些病毒HA和NA基因与2007-2009年分离的H9N2病毒相比,核苷酸序列同源性分别为86.7%-94.3%,与2010-2014年病毒相比分别为94.6%-97.8%,2015-2016年毒株之间HA和NA序列核苷酸同源性为95.1%-99.1%。基因组分析显示,这些病毒都属于S基因型。与2013年之前的H9N2病毒相比较,这些病毒在各个基因片段都已经发生了多个氨基酸位点的变异,包括HA基因Q226L的突变,PB2基因I293V、T598V和L648V的突变,PA基因K356R的突变等。这些适应性的突变可能有助于增强病毒聚合酶活性,使病毒在新宿主中能够有效的复制。另外,PB2基因E627K被认为是禽流感病毒哺乳动物适应性的分子标记,本研究中我们发现了 2个分离株发生该位点的突变。H9N2病毒与2010年之前的病毒相比遗传多样性减少(目前华东地区家禽流行的几乎只有S基因型一种),但是8个基因随着时间的推进表现出了遗传多样性的演化。病毒一些适应性突变使得病毒的致病性增强,为了避免新的大流行病爆发,采取更为有效的方法研究调查这些分子标记物是十分必要的。3.华东地区不同年代H9N2亚型禽流感病毒致病性及传播特性研究为了探索当前流行的S基因型H9N2病毒在鸡群中致病性和有效传播的能力的变化,我们选择 6 株 AH320/2016、SDKD1/2015、TM118/2014、WJ57/2012、HeN86/2008、SH7/2001感染SPF鸡进行病毒致命性和传播实验。本研究中,SH7是已被证实的具有气溶胶传播性的病毒,作为本研究气溶胶传播的阳性对照。实验结果表明,近几年的毒株SDKD1、AH320、TM118与早期毒株WJ57和HeN86相比,可以从多个组织器官中检测出,而且它们在组织中复制时间较长,病毒载量更高。气溶胶传播试验表明,与早期的毒株HeN86相比,WJ57的气溶胶传播组3只鸡中,有1只检测到了排毒,但是晚期毒株SDKD1、AH320的气溶胶传播组从感染后第5天至第9天均能检测出排毒,而且具有很高的病毒滴度以及血清转化水平。结果表明最近的病毒都具有了气溶胶传播性,这有助于病毒与哺乳动物受体相结合,使得病毒具有跨物种传播的潜力。