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第一部分重组人色素上皮衍生因子在大肠杆菌中的制备及活性鉴定背景:早产儿视网膜病(Retinopathy of prematurity, ROP)是世界范围内儿童致盲的主要原因,其主要发病机制为视网膜新生血管的形成。药物治疗是目前研究的热点。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor, PEDF)是已知的天然存在于人眼内的最强有力的血管增生抑制因子,能有效抑制ROP动物模型新生血管增生。目的:采用基因克隆和重组表达技术,合成人PEDF cDNA,在原核表达载体pET28a构建重组表达质粒pET28a-PEDF,优化表达和纯化条件,以期能以高效、简单的方法获得具有生物学活性的重组人PEDF蛋白。方法:根据已知的GeneBank中人PEDF cDNA成熟蛋白编码区序列设计特异性引物(上下游引物分别有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点)。以全基因合成的pUC57-PEDF质粒为模板,经PCR扩增人PEDF基因,EcoRⅠ和HindⅢ对扩增产物进行双酶切,琼脂糖电泳回收1.2 kb酶切片段。EcoRⅠ和HindⅢ对载体pET28a进行双酶切,琼脂糖电泳回收5.3 kb酶切片段。用T4连接酶连接1.2 kb的PEDF目的片段和5.3 kb的pET28a片段。将连接产物转化到E.coli DH5a感受态细胞中,并应用带卡那霉素抗性的LB固体培养基筛选,挑取单个阳性菌落,LB液体培养基培养后,提取纯化质粒,进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切、PCR、测序鉴定。将重组质粒pET28a-PEDF转化大肠杆菌BL21(DE3),以建立高效表达人PEDF重组蛋白的工程菌株;IPTG诱导表达PEDF,SDS-PAGE和Westernblot确证为重组PEDF蛋白,发现蛋白主要以包涵体形式表达。用8M Urea对包涵体蛋白进行变性,变性蛋白经Ni-NTA树脂纯化,复性后得到有生物活性的重组蛋白。BCA法测定蛋白含量。采用MTT法检测所获得的重组蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖有抑制活性。结果:PCR、酶切鉴定和测序结果表明:本研究成功构建了人PEDF cDNA成熟蛋白质编码区序列的原核表达载体pET28a-PEDF,IPTG诱导表达重组蛋白,经变、复性获得可溶性PEDF,产量约为每升菌液8.3mg;重组人PEDF抑制人脐静脉内皮细胞的增殖效果随PEDF浓度增加而增加,呈明显的剂量依赖关系,EC50为80nmol/L。结论:获得了可以表达人PEDF cDNA成熟蛋白质编码区序列的大肠杆菌工程菌株:pET28a-PEDF-BL21 (DE3),建立了从不溶性包涵体中获得具有生物学活性的可溶性重组蛋白的方法。为早产儿视网膜病(ROP)的药物防治提供重要基础。第二部分重组人色素上皮衍生因子在SP2/0细胞中的瞬时表达及活性鉴定目的:将人PEDF基因插入真核表达载体pIRESneo3中,构建真核表达质粒PIRESneo3-PEDF。构建成功的pIRESneo3-PEDF表达质粒通过脂质体转染试剂LipofectaminTM2000转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,并检测人PEDF在SP2/0中的瞬时表达。方法:根据已知的GeneBank中人PEDF cDNA成熟蛋白编码区序列设计特异性引物(上下游引物分别有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点)。以全基因合成的pUC57-PEDF质粒为模板,经PCR扩增人PEDF基因,EcoRⅠ和NotⅠ对扩增产物进行双酶切,琼脂糖电泳回收1.2 kb酶切片段。EcoRⅠ和NotⅠ对载体pIRESneo3进行双酶切,琼脂糖电泳回收5.2 kb酶切片段。用T4连接酶连接1.2kb的PEDF目的片段和5.2 kb的pIRESneo3片段。将连接产物转化到E.coliDH5a感受态细胞中,并应用带氨苄青霉素抗性的LB固体培养基筛选,挑取单个阳性菌落,LB液体培养基培养后,提取纯化质粒,进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切、PCR、测序鉴定。将重组质粒pIRESneo3-PEDF与脂质体转染试剂LipofectamineTM2000混合后转染SP2/0细胞,无血清培养基培养24小时后,Western blot法对表达产物进行鉴定。收集转染细胞的培养上清,MTT法检测重组PEDF蛋白的活性。结果:PCR、酶切鉴定和测序结果表明pIRESneo3-PEDF表达载体构建成功。脂质体法将表达质粒成功转染到SP2/0中,经无血清培养,可分泌表达,Westernblot证明其为人色素上皮衍生因子,分子量为50KDa。采用MTT法检测重组蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖有抑制活性。结论:成功构建人PEDF蛋白表达质粒pIRESneo3-PEDF,转染细胞可瞬时分泌表达有活性的人PEDF,为开展下一步稳转表达及蛋白纯化奠定基础,为早产儿视网膜病(ROP)的防治带来新的希望。