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目的本实验通过探索建立小鼠EAU动物模型,对比研究MSCs及阻断CD73功能的MSCs对EAU的治疗效果,观察临床、病理表现及视网膜功能改变,明确CD73在MSCs免疫调节过程中的重要作用。另外,检测小鼠脾脏及颈部引流淋巴结中T淋巴细胞增殖能力及分化情况,并分析MSCs对T淋巴细胞表面CD73表达的影响,以阐明MSCs通过CD73/腺苷信号对EAU进行免疫调节的作用机制。最终进一步完善MSCs的免疫调节机制网络,为临床应用MSCs治疗葡萄膜炎等自身免疫性疾病提供新的方法和理论基础。方法1.MSCs培养:C57BL/6小鼠脂肪来源MSCs的分离、培养与鉴定,人脂肪来源MSCs的分离、培养。2.建立EAU动物模型:过继转移IRBP1-20抗原特异性T淋巴细胞至C57BL/6小鼠建立过继转移EAU动物模型。3.MSCs预处理:在MSCs体外培养体系中加入CD73竞争性抑制剂APCP,过夜,待用。4.MSCs治疗:过继免疫后第10天,PBS对照组、MSCs治疗组及经APCP预处理的MSCs治疗组分别行单次尾静脉注射1ml无菌PBS、MSCs单细胞悬液或经APCP预处理的MSCs单细胞悬液。5.临床观察:过继免疫后第8天至60天,隔日观察EAU小鼠眼底发病情况,并根据Caspi临床分级评分。6.组织病理学观察:过继免疫后第60天,处死各组小鼠,制备视网膜组织切片,行组织病理学观察,并根据Caspi病理分级评分。7.视网膜功能检测:过继免疫后第25、35、45、60天分别对各组小鼠进行ERG检测,评价视网膜功能。8.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)测定T细胞增殖:过继转移后第21天,取各组EAU小鼠脾脏和引流淋巴结T细胞,在0、1、10、30μg/ml IRBP1-20抗原刺激下培养,Brdu法检测体内T细胞增殖指数。另外,取过继转移后第21天模型对照组EAU小鼠脾脏和引流淋巴结细胞,将MSCs或经APCP预处理的MSCs与T淋巴细胞按1:5、1:10、1:20混合培养,在CD39抑制剂POM-1、CD73抑制剂APCP或A2A腺苷受体拮抗剂SCH58261干预下,Brdu法检测体外T细胞增殖指数。9.T细胞分化检测:过继转移后第21天,取模型对照组EAU小鼠脾脏和引流淋巴结T细胞,与MSCs或经APCP预处理的MSCs混合培养,应用流式细胞仪分析CD4+IL-17+细胞及CD4+Foxp3+细胞比例。10.MSCs表面CD73功能检测:应用孔雀绿比色实验及高效液相色谱法检测CD73的核苷酸外切酶功能及MSCs培养上清中腺苷的生成量。11.T细胞表面CD73表达变化检测:过继转移后第21天,取模型对照组EAU小鼠脾脏和引流淋巴结T淋巴细胞,与MSCs共培养或在MSCs分泌的各种细胞因子干预下混合培养,流式细胞仪检测各组活化的CD4+T淋巴细胞表面CD73的表达差异。结果1.成功分离培养小鼠脂肪来源MSCs及人脂肪来源MSCs,并鉴定。2.成功建立小鼠过继免疫EAU模型。3.临床观察显示,MSCs治疗组临床评分较空白对照组显著降低(P<0.05),而经APCP预处理的MSCs治疗组临床评分显著高于MSCs治疗组(P<0.05)。4.组织病理学观察显示,MSCs疗法显著减轻视网膜组织损伤(P<0.05)。经APCP预处理的MSCs对于视网膜结构的保护作用大大减弱(P<0.05)。5.视网膜功能检测显示,MSCs疗法对EAU小鼠的视网膜功能具有显著的保护作用(P<0.05),而经APCP预处理的MSCs对视网膜功能的保护作用大大降低(P<0.05)。6.T细胞增殖实验显示,MSCs可显著抑制IRBP1-20抗原特异性T细胞增殖(P<0.05)。而经APCP预处理的MSCs对T细胞的增殖抑制能力大幅减弱(P<0.05)。当CD39/CD73/腺苷通路上任何环节被阻断,T细胞均可呈现显著增殖。7.T细胞分化实验显示,MSCs共培养可明显提高CD4+T细胞中Foxp3+T细胞相对于IL-17+T细胞的比例(P<0.05)。8.孔雀绿比色实验及高效液相色谱法检测显示,MSCs表面CD73具有核苷酸外切酶的功能,可将AMP降解为腺苷,APCP可显著抑制其功能(P<0.05)。9.T细胞表面CD73表达差异检测显示,MSCs共培养可上调活化T细胞表面CD73的表达水平(P<0.05),这种作用是由其分泌的TGF-β1实现的。结论1.小鼠脂肪来源MSCs可显著缓解EAU的临床病程。2.MSCs可通过其表面CD73与T细胞表面CD39/CD73共表达抑制自身免疫性反应。3.MSCs可上调活化T细胞表面CD73的表达,从而增强局部免疫抑制效果。