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近年来,人们发现嘌呤信号分子及其受体在神经发育及其生理功能中,发挥着重要作用,它们通过介导神经元和胶质细胞间的相互作用,参与调控神经发生、神经元迁移和轴突生长等生理过程。同时,在多种神经病变中,如中风、脑外伤、阿尔茨海默病、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症、癫痫、神经疼痛中,嘌呤信号分子以及胶质细胞活化发挥着重要作用。米诺环素是一种半合成的第二代四环素衍生物,较其他四环素类药物亲脂性高,能够通过血脑屏障到达中枢神经系统,对多种神经系统疾病模型具有很好的改善作用。但在抗脑缺血实验研究中,关于米诺环素的作用报道不一,本研究观察了米诺华素对大鼠脑缺血急性期嘌呤受体P2X7以及胶质细胞活化的影响,并初步探讨了药物的作用机制。1米诺环素对脑缺血大鼠神经元损伤的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠神经元损伤的影响。方法:采用大鼠中动脉栓塞(MCAO)再灌注模型,用免疫组织化学法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对大鼠缺血侧脑组织中NeuN表达的影响。结果:在大鼠缺血侧皮层及纹状体区域,各组神经元细胞核呈NeuN阳性表达;两个区域内的NeuN细胞数组间无统计学差异,但NeuN表达量组间有差异。米诺环素22.5 mg/kg、45mg/kg组与MCAO损伤组相比,皮层及纹状体区域NeuN表达量均显著降低(P<0.05)。同时,各组NeuN在神经元的细胞核上分布存在一定差异,其中,假手术组神经元NeuN在细胞核呈圆形或卵圆形分布,MCAO损伤组神经元NeuN呈梭形分布,通过综合观察DAPI细胞核染色结果,初步判断这是细胞核的一种固缩现象。米诺环素22.5 mg/kg、45mg/kg组神经元NeuN呈更小的梭形或三角形分布。纹状体区域的神经元细胞核以及NeuN表达与皮层有类似现象,其中,米诺环素组细胞核固缩更加明显。结论:在脑缺血后24小时,米诺环素能进一步加重脑缺血后神经元损伤。2米诺环素对脑缺血大鼠nNOS的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠nNOS的影响。方法:采用Western Blot法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对脑缺血大鼠缺血侧脑组织中nNOS的影响。结果:MCAO损伤组与假手术组相比,nNOS含量明显降低(P<0.05),下降率高达84%;给予米诺环素22.5mg/kg、45mg/kg后,分别使nNOS含量升高109%(P>0.05,与MCAO损伤组相比)、233%(P<0.05,与MCAO损伤组相比)。结论:诺环素可以使脑缺血后脑组织nNOS表达增加。3米诺环素对脑缺血大鼠小胶质细胞激活的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠小胶质细胞激活的影响。方法:采用免疫组织化学法及小胶质细胞特异性标记物Iba1,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对脑缺血大鼠缺血侧脑组织中Iba1表达的影响。结果:各组大鼠脑组织缺血侧皮层及纹状体的Iba1细胞数无显著差异。但是,MCAO损伤组与假手术组相比,大鼠脑组织缺血侧皮层及纹状体的Iba1表达量明显增多(P<0.05),各区域分别增加78.97%、89.62%;米诺环素给药组与MCAO损伤组相比,无明显差异。此外,小胶质细胞的形态也存在一定差异,具体表现为:假手术组的小胶质细胞突起呈放射状,均匀朝向各个方向;MCAO损伤组与假手术组相比,突起长度变长,数目增多,细胞体积变大;米诺环素给药组与MCAO损伤组相比,细胞形态相似。结论:米诺环素对脑缺血再灌注后小胶质细胞激活没有抑制作用。4米诺环素对脑缺血大鼠IL-1β、TNF-α的影响目的:观察米诺环素对脑缺血大鼠IL-1 β、TNF-α的影响。方法:采用酶联免疫法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对脑缺血大鼠缺血侧脑组织中IL-1β、TNF-α的影响。结果:MCAO损伤组与假手术组相比,IL-1β和TNF-α含量均无明显差异;米诺环素22.5mg/kg组与MCAO损伤组相比,IL-1β和TNF-α含量分别升高45%、40%,且均有统计学差异(P<0.05)。结论:在该观测时间点,IL-1β和TNF-α还未大量释放到细胞间隙;而米诺环素具有促进二者释放的作用。5米诺环素对脑缺血大鼠P2X7受体的影响目的:米诺环素对脑缺血大鼠P2X7受体的影响。方法:采用免疫组织化学法,观察大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对缺血侧皮层及纹状体P2X7受体表达的影响。结果:P2X7广泛分布在大鼠大脑皮层及纹状体区域的神经元和小胶质细胞上。在大鼠缺血侧各区域内,各组P2X7阳性细胞数无明显差异,但在纹状体区域,米诺环素22.5mg/kg、45mg/kg组P2X7阳性细胞数与MCAO损伤组相比,分别减少54.93%、24.00%。此外,P2X7/NeuN和P2X7/Iba1免疫组化结果显示,在大鼠缺血侧皮层及纹状体区域,各组P2X7/NeuN和P2X7/Iba1双标的阳性细胞数无显著差异(P>0.05),但在纹状体区域,与MCAO损伤组相比,米诺环素22.5mg/kg、45mg/kg组分别使P2X7/NeuN双标的阳性细胞数降低50.93%、28.90%。结论:脑缺血24小时后,小胶质细胞上的P2X7受体没有被激活,而米诺环素有抑制缺血侧纹状体区域神经元P2X7受体表达的趋势。综上所述,大鼠MCAO损伤1h再灌注24h后,米诺环素对P2X7受体及小胶质细胞激活无明显影响,但却能加重神经元损伤,该损伤作用可能与促进nNOS表达,增加IL-1β和TNF-α释放有关。