戊型肝炎（Hepatitis E）是一种由戊型肝炎病毒（HEV）引起的自限性疾病。大多数个体感染后若干周内能够自行康复,但在器官移植患者、血液肿瘤患者和HIV感染者中,HEV感染后将会引起慢性肝炎,并迅速发展为肝纤维化和肝硬化,同时伴有病毒性脑炎、后循环缺血、周围神经病变等肝外症状。在我国,HEV-1和HEV-4是造成戊型肝炎的主要病原体。其中,HEV ORF3蛋白在病毒感染早期表达且会引起体内抗体的产生,因此抗ORF3蛋白抗体的滴度检测可以作为早期急性感染、慢性感染或准包膜状态的辅助诊断指标。目前市面上HEV商品化检测试剂盒主要利用间接ELISA方法进行检测,其灵敏性和特异性较高,可以同时检测HEV-1到4型,但该方法对包被抗原的纯度要求较高,且无法进行不同基因型鉴别诊断。基于此,本研究选取基因1型HEV的代表株SAR55,利用原核表达系统表达可溶性HEV-1 ORF3SAR55重组蛋白,并利用该蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤融合技术筛选制备了抗HEV-1的ORF3蛋白的单克隆抗体,并通过与HEV-3和HEV-4 ORF3抗原交叉反应筛选得到1株抗HEV-1 ORF3蛋白特异性的单抗,并进行HRP标记,利用标记的HRP蛋白建立了检测人血清中抗HEV抗体的竞争ELISA,为HEV感染的临床诊断提供了新方法。本研究的主要内容和结果如下:1.成功构建了pET-21b-ORF3SAR55重组质粒,将其导入表达菌BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明成功表达出与预期大小一致14 k Da的可溶性ORF3SAR55重组蛋白;利用Ni柱亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的ORF3SAR55重组蛋白,产量约为32 mg/L。2.利用ORF3SAR55重组蛋白免疫Balb/c小鼠,冲击免疫一周后采集脾脏进行细胞融合,并通过i ELISA及亚克隆筛选,获得3株稳定分泌ORF3SAR55抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C11,1D2和8H8。将杂交瘤细胞腹腔注射给小鼠10天后收集腹水,利用Protein G beads纯化后成功获得了单克隆抗体,同时对单抗亚型进行鉴定,结果显示3C11属于Ig G2b,1D2和8H8均属于Ig G2a,且与HEV-3和HEV-4 ORF3蛋白交叉反应显示,单抗1D2与HEV-1 ORF3蛋白特异反应,不同其它基因型的反应。3.将单抗1D2与HRP进行体外标记,然后利用HRP-1D2为竞争试剂,ORF3SAR55蛋白为包被抗原,建立了HEV抗体检测的竞争ELISA。该方法的抗原最佳包被量为50μg/孔,HRP-1D2（1 mg/m L）最佳稀释度为1:1000,血清最佳稀释比为1:10,反应时间为37℃1 h;其敏感性为100%,特异性为99.2%;板内板间变异系数为1.38%～7.13%。并且与基因3型HEV抗体阳性兔血清和4型阳性猪血清无竞争性。综上所述,本研究成功筛选和制备了抗基因1型HEV ORF3蛋白的单抗,并成功偶联HRP,利用该HRP标记单抗建立了检测人血清中HEV抗体的竞争ELISA方法,为临床中HEV感染的检测提供了新的方法。