草鱼(Ctenopharyngodon idella)中链脂肪酸受体Gpr84分子克隆、组织表达和功能研究

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G蛋白偶联受体84(G-protein-coupled receptor 84,Gpr84)是一种代谢物感受型G蛋白偶联受体(Metabolite-Sensing G Protein-Coupled Receptors),能被中链脂肪酸激活,并提高炎性因子表达,引起机体炎症反应从而参与机体的免疫调节。草鱼生长快,产量高,肉质鲜美,是我国重要的养殖种类。但是由于感染或饲喂不当等原因,草鱼炎症一直是造成草鱼养殖巨大经济损失的常见疾病。本试验旨在通过探究草鱼Gpr84与炎症之间的关系,以进一步探究草鱼炎症的发病机制,为草鱼养殖的健康发展提供建议和帮助。为此,本试验以预测的草鱼Gpr84序列为模版,采用Primer 5.0软件设计引物,从转录组m RNA中克隆获得草鱼Gpr84 CDS,并在生物信息学分析的基础上对草鱼Gpr84基因的组织表达和基因功能进行了分析和验证。获得如下结果:1.克隆序列测序结果表明,草鱼Gpr84 CDS区含有1224个核苷酸,编码407个氨基酸,其编码的蛋白具有七个跨膜结构域,具有G蛋白偶联受体典型特征。且多序列比对分析表明草鱼Gpr84两个基序SRY和NPxx Y以及L104,F105和N108等癸酸结合位点在鱼类中高度保守。2.实时荧光定量PCR结果显示,草鱼Gpr84在8种组织的中的表达由高到低依次是肝脏、脾脏、肠、鳃、心脏、肌肉、脑、肾脏。其中在肝脏和脾脏组织中表达量显著高于其他组织(P<0.05),在肝脏中的表达量显著高于脾脏(P<0.05),而其他组织表达量较低且相互之间差异不显著(P>0.05)。脾组织中草鱼Gpr84表达量仅次于肝组织,显著高于其他组织。3.功能验证试验发现,癸酸、十一酸和月桂酸等中链脂肪酸可有效激活转染到人肾胚胎细胞293T中的草鱼Gpr84受体并激活ERK信号通路并抑制c AMP信号通路。其中月桂酸激活ERK信号通路的效率最高,癸酸抑制c AMP信号通路的效率最高。与哺乳动物不同的是,二吲哚甲烷不能激活草鱼Gpr84。4.草鱼在体干扰试验显示,根据草鱼Gpr84的编码区设计并构建的sh RNA可有效降低草鱼Gpr84表达。与对照组相比,注射中链脂肪酸(癸酸)能够上调Gpr84与炎症因子inos、il-1β和il-6的表达,而草鱼Gpr84表达被抑制下调后,与之对应的inos、il-1β和il-6等炎症因子的表达量也显著降低。说明Gpr84参与免疫调节,能够影响草鱼体内炎症因子的表达。以上研究结果显示,本试验成功克隆草鱼Gpr84编码区,编码的蛋白具有G蛋白偶联受体的共同结构特征和鱼类中的保守位点,其在肝脏、脾脏等具有免疫功能中的器官高表达,癸酸、十一酸和月桂酸等中链脂肪酸可有效激活ERK信号通路并抑制c AMP信号通路,从而调控inos、il-1β和il-6等炎症因子的表达量。表明草鱼Gpr84是中链脂肪酸受体,并通过调控炎症反应参与机体免疫调控。
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