研究背景胶质瘤是一种起源于脑或脊髓的胶质细胞的原发性肿瘤,胶质母细胞瘤是脑胶质瘤的一个重要分类,占到恶性脑肿瘤的80%以上,是最常见的并最有侵袭性的恶性原发脑肿瘤(WHO Ⅳ级)。胶质母细胞瘤标准的治疗方法是手术切除并辅以术后放化疗,但是由于肿瘤高度恶性,治疗效果差,患者预后极度恶劣,对人类健康危害性极大。由于胶质母细胞瘤对常规的治疗方法不敏感而对脑组织的治疗副作用很大,使得胶质母细胞瘤的治疗十分棘手。因此,胶质母细胞瘤的发病机制及治疗研究是当下的一个热点。尽管随着医学生物学研究的发展,对胶质母细胞瘤的生物学特点也越来越了解,并发现了一些新的治疗靶点,而且已经证实有许多信号通路参与到胶质母细胞瘤的发生、发展及起与耐药和复发相关,然而人们对这一复杂的调控网络的认识还远远不足,很多治疗手段还是不尽如人意。对胶质母细胞瘤进行分子生物学研究,探索其发病及治疗规律,开发新的有效的药物,是胶质母细胞瘤治疗研究的一个意义重大的方向。膳食药剂例如多酚、黄酮是一类提取于蔬菜水果的化合物的统称。Curcumin等由于有着较强的抗肿瘤活性,已经得到了很深入的研究。它是姜科植物姜黄(Curcuma Longa)的根茎提取物,具有广泛的药理作用,能够抗炎、抗氧化、抗肿瘤。除了能够预防肿瘤,Curcumin还可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移,还可以诱导细胞凋亡,发挥治疗作用。Curcumin抗肿瘤的药理活性是通过其调节多种转录因子、细胞因子、炎症因子、蛋白激酶,以及各种活性蛋白等来实现的。它作用于肿瘤发生发展的各个重要信号通路上,发挥其抗癌的作用,特别是Curcumin对胶质母细胞瘤具有很好的抑制肿瘤活性的作用。利用Curcumin本身防治胶质母细胞瘤或者以它为参考研发新药,对胶质母细胞瘤的治疗有重大的意义。细胞周期是细胞存活和增殖的重要事件,受多个因素严密调控。细胞周期检查点是调节细胞精确分裂的重要机制,最主要的两个检查点分别G1检查点和G2检查点。这些检查点的作用就是保证细胞在完成细胞周期的一个阶段后才能进入到下一个阶段。肿瘤细胞增殖活跃,而抗肿瘤药物作用的一个重要机制就是引起DNA损害,干预细胞有丝分裂,使其不能完成细胞周期某个阶段的准备,从而停滞在某个检查点,或者G1,或者G2。细胞周期的有关活动受Cyclin和CDK调控。为调节每个阶段正常进行,细胞自身具有调节不同周期阶段各种变化的激酶的调节机制。许多相关的调节蛋白,在有丝分裂和染色体分离过程中起着重要作用,保证产生正确的子细胞。肿瘤细胞增殖往往与遗传性的或表观遗传性的细胞周期相关蛋白的表达异常或者对细胞周期检查点的控制失衡引起的,导致了对细胞损伤的异常应答。这些变化,不仅使细胞获得生长增殖方面的优势,而且还会使之易于积累那些可能促发肿瘤发生的遗传变异,从而获得具有侵袭性的表型。近年来,能够调节细胞周期的抗肿瘤药物逐渐引起了人们的重视。一些药物,本身就是Cyclin或者CDK抑制剂。因此,针对细胞周期有关的抗癌药物及肿瘤发生机制的研究具有重要意义。凋亡是一种程序性细胞死亡,可由多种刺激引起。凋亡在多种生命过程中起重要作用,例如,正常细胞循环、胚胎发育及个体发育,免疫系统行使功能和药物诱导的死亡等。近二十年来的研究表明,凋亡是影响甚至决定肿瘤发生的重要事件。对凋亡有关的信号通路的研究提示了凋亡是如何由肿瘤细胞在肿瘤发生过程中对生理性的应激反应或者在肿瘤治疗过程中对抗肿瘤药物的反应所激发的。在引起凋亡的应激反应中,比较重要的是由于促癌基因信号水平升高以及与DNA损害相关性增殖信号增强引起的信号失衡。凋亡信号分为上游的调节信号和下游的作用信号。就其调节信号,分为两大系统。其一接受处理细胞间的死亡诱导信号,另一接受细胞内来源的信号刺激。这两条通路分别激活Caspase-8和Caspase-9,而后,最终激活均行使凋亡功能的Caspase-3,诱导凋亡。对许多肿瘤包括胶质母细胞瘤,其发生往往源于凋亡调节通路功能障碍,如NF-κB, STAT3, PI3K/Akt以及p53等,导致了机体不能有效地调控细胞凋亡,使受到肿瘤发生信号影响的细胞获得性状改变,生长永生化并获得侵袭性。所以,进一步研究这些通路有关的肿瘤发生及凋亡机制,针对这些信号通路进行抗癌药物研究,对治疗肿瘤有极大帮助。DAPK1(Death Associated Protein Kinase1)是一种钙离子/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶。它是一种多功能域蛋白,包括激酶功能域、钙调节功能域、锚蛋白重复区、磷酸绑定襻,并有一个C末端死亡功能域。它的C末端死亡功能域起着蛋白相互作用和形成死亡诱导信号复合物的作用。DAPK1在多种信号通路中发挥作用,可通过死亡功能域与其它蛋白相互作用,能够诱导Caspase相关的凋亡和p53介导的细胞死亡。除了诱导凋亡作用,通过与Beclin-1作用,它还能提高自噬相关的细胞死亡。DAPK1作为一种肿瘤抑制基因,它的表达沉默与一些肿瘤的发生相关。不过,DAPK1在肿瘤细胞凋亡有关的信号通路中的作用尚未完全清楚,有待于进一步的研究。表观遗传是指在有丝分裂和减数分裂中可遗传的但不能用DNA序列改变来解释的变化。过去十几年的研究发现其中最为主要和重要的是肿瘤的发生和进展。最常见的两种表观遗传现象是DNA甲基化和组蛋白修饰。启动子区域的低甲基化水平与基因的活跃表达有关。约有一半的基因因为在启动子区域有CpG岛而转录活跃,而转录起始位点附近的甲基化会抑制基因表达。对肿瘤来说,DNA甲基化是一种保持基因长期沉默的手段。组蛋白乙酰化促进基因表达,而组蛋白去乙酰化抑制基因表达。组蛋白甲基化对基因表达则可能是激活也可能是抑制。DNA甲基化抑制剂有两大类,一类是拟核苷剂,一类是非拟核苷剂。近来的研究发现这类药物能以较小的剂量取得较大的效果。进一步的临床试验研究了这些DNMT抑制剂用于治疗实体瘤,如乳腺癌,结肠癌,肾癌等。还有研究者把DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂结合起来,研究发现它们在抑制肿瘤的基因表达和生长方面有协同作用。所以,表观遗传学研究会给肿瘤治疗提供新的广阔空间,对一些肿瘤抑制基因的表观遗传改变的控制将有助于指导针对相关肿瘤的新药研究。研究目的研究膳食药剂Curcumin引起胶质母细胞瘤细胞凋亡和周期停滞的分子机制。研究肿瘤抑制基因DAPK1在Curcumin抑制胶质母细胞瘤细胞中的作用。研究Curcumin调节基因胶质母细胞瘤中RANK表达的表观遗传学机制。技术方法1. Curcumin诱导U251细胞凋亡和周期停滞机制研究用不同浓度的Curcumin (0μM,5μM,10μM,20μM,40μM,80μM)处理U251细胞24小时,用CCK-8检测Curcumin对U251细胞增殖的影响。用40μM Curcumin处理U251细胞24小时,PI染色后用流式细胞仪检测细胞周期变化。用40μM Curcumin处理U251细胞24小时,光镜下检测U251细胞形态学变化,Annexin V-FITC/PI双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡。以0μM,20μM,40μM Curcumin处理U251细胞24小时,Real-time RT-PCR及Western Blotting检测相关基因的表达变化。2. DAPK1在Curcumin抑制胶质母细胞瘤细胞中的作用机制DAPK1siRNA转染U251细胞,沉默DAPK1表达。Western Blotting检测Curcumin对DAPK1沉默的U251细胞STAT3和NF-κB磷酸化水平的变化。EMSA检测Curcumin对DAPK1沉默的U251细胞STAT3/DNA和NF-κB/DNA结合能力的影响。Western Blotting检测Curcumin对DAPκ1沉默的U251细胞中Caspase-3及期激活片段表达的影响。PI染色后用流式细胞仪检测Curcumin对DAPK1沉默的U251细胞细胞周期停滞的影响。Annexin V-FITC/PI双染色后用流式细胞仪检测Curcumin对DAPK1沉默的U251细胞凋亡的影响。3. Curcumin调节基因胶质母细胞瘤中RANK表达的表观遗传学机制用OμM,15μM和30gM的Curcumin处理U251及U87细胞4日,RT-PCR, Real-time RT-PCR及Western Blotting检测RANK的表达变化。用30gM的Curcumin或者20μM DAC处理U251及U87细胞4日,MSP检测RANK启动子甲基化状态,并对U251细胞RANK启动子区进行BSP测序,检测甲基化变化。M.SssⅠ抑制实验体外验证Curcumin对DNMT1的抑制作用。siRNA转染沉默STAT3表达,对U251细胞RANK启动子区进行BSP测序,检测甲基化变化。4.统计方法所有数据用均数±标准差(χ±s)表示,使用SPSS13.0统计学软件,对所测得的结果进行正态性及方差齐性检验。两组间比较采用两样本t检验；多组问比较采用单因素方差分析,若方差齐性,多组间两两比较则用LSD检验,方差不齐选用Dunnett’s T3检验。检验水准为α=0.05,P<0.05认为有显著差异。研究结果1. Curcumin能够诱导U251细胞凋亡和周期停滞我们首先采用不同浓度的Curcumin处理U251细胞24小时,结果发现5μMCurcumin处理细胞,对U251细胞增殖抑制率没有明显的作用,而10μM以上的浓度处理24h后,对细胞增殖均产生了明显的抑制效果(F=681.763,P=0.000)。我们发现Curcumin诱导人胶质母细胞瘤细胞在G2/M期停滞。经40μM Curcumin处理24小时,检测周期变化发现,与阴性对照即未处理组相比,U251细胞G0/G1期细胞明显减少(t=23.091, P=0.000)。Curcumin诱导U251细胞产生G2/M期停滞,而不引起G1期停滞。使用FACS检测凋亡结果显示,使用40μMCurcumin处理U251胶质母细胞瘤细胞24h后检测凋亡情况,与未经药物处理的对照组对比结果显示,未处理的细胞凋亡极少；而40gM的Curcumin处理24h后,凋亡细胞增多(F=42.329,P=0.000)。同时还发现Curcumin主要通过诱导凋亡来抑制细胞增殖,而并不导致其大量坏死。由于肿瘤细胞能量的主要来源是糖酵解,我们首先检测了糖酵解有关的基因表达情况,结果发现对所检测的糖酵解通路上的几个重要基因,不同剂量Curcumin处理24h均未发现Curcumin对这些基因mRNA水平的表达有抑制作用,尤其是肿瘤供能的关键酶PKM2,无论其mRNA水平还是蛋白水平,Curcumin均未影响其表达。不过,HK2的表达反而有所升高。对于细胞周期阻滞,结果显示,经过40gM的Curcumin处理24h的U251细胞,Cyclin D1的表达水平随并没有明显变化(F=3.534,P=0.097)而Cyclin B1的表达降低(F=178.522,P=0.000)。说明Curcumin诱导的G2/M期停滞是由于Cyclin B1的表达引起的,而不是通过Cyclin D1。我们检测发现,Curcumin能抑制Akt磷酸化,较大剂量(40μM)的Curcumin还能抵制Akt的表达。同时,Curcumin引起FOXO1的去磷酸化,并且发生核浆转移,从而得到激活。但是,Curcumin对FOXO1的表达产生的影响不明显。由于磷酸化是这些转录因子的激活状态,这仍然说明Akt/FOXO1通路在Curcumin抑制增殖和诱导凋亡中起着重要作用。我们的研究还发现,无论是基因表达水平还是蛋白水平,Curcumin能抑制cIAP2(BIRC3), Survivin(BIRC5)的表达。研究还发现,Curcumin并不影响其它成员如cIAP1(BIRC2), Livin(BIRC7)的水平。可见,BIRC/IAP蛋白家族成员也参与Curcumin对人胶质母细胞瘤细胞的诱导凋亡的作用。我们同时还研究了Curcumin对其配体TRAIL表达的作用,结果发现,Curcumin能提高TRAIL的表达,这说明,Curcumin通过死亡信号通路引起细胞凋亡的过程中,TRAIL也起到一定作用。2. DAPK1能够调节Curcumin引起的胶质母细胞瘤调亡和周期停滞我们首先观察到Curcumin处理U251细胞引起DAPK1mRNA表达的升高,并且随浓度增大而增大(F=165.016,P=0.000)。随后的WB检测证实了这一点,同时也证明这一升高也是时间依赖性的,即同一Curcumin浓度处理不同时间,时间越长,DAPK1增高越明显。这些结果证实了Curcumin能够提高U251细胞中DAPK1的表达。我们进一步研究DAPK1表达水平的变化是否与STAT3和NF-κB磷酸化水平的改变有关。因此,我们应用siRNA干扰技术沉默DAPK1的表达,两种所选用的siRNA干扰序列均成功地沉默了DAPK1的表达。DAPK1表达沉默并不影响STAT3和NF-κB表达的改变。另外,Curcumin也不再能够升高转染si-DAPK1细胞中DAPK1的水平。其后,我们检测了这两种转录因子的磷酸化水平。如图所示,Curcumin的确抑制了STAT3和NF-κB的磷酸化水平,而DAPK1表达沉默则减轻了细胞对Curcumin所引起的STAT3和NF-κB去磷酸化作用。我们而后研究干扰DAPK1表达能否调节不同Curcumin处理时间所引起的去磷酸化作用。WB结果显示沉默DAPK1表达可以减缓不同Curcumin处理时间所引起的去磷酸化。然而,虽然NF-κB的磷酸化水平也被Curcumin极大地抑制了,干扰DAPK1表达却没能很好地减轻这一抑制作用。沉默DAPK1表达减轻Curcumin引起的STAT3和NF-κB DNA结合能力的降低。转录因子经过活化后便具有与DNA结合的能力,一般说来转录因子磷酸化表示它的激活状态。因此通过EMSA方法研究了DAPK1表达沉默对Curcumin引起的STAT3和NF-κB DNA结合能力降低的影响。结果发现,当以40μM Curcumin处理U251细胞4h后,STAT3和NF-κB的DNA结合能力显著受到抑制。干扰DAPK1表达尽管没能完全恢复STAT3和NF-κB的DNA结合能力,但确实减轻了Curcumin对它的抑制。因此可以从以上结果推断DAPK1能够促进Curcumin对STAT3和NF-κB DNA结合能力的抑制作用。我们还检查了干扰DAPK1表达对Curcumin诱导的Caspase-3活化的作用。发现Curcumin激活了U251细胞中Caspase-3的活性,表现为WB电泳出现17kDa和19kDa两条带。在DAPK1沉默的细胞中,这两条带与si-Ctrl组相比表达量降低,说明Caspase-3激活受到了抑制,表明DAPK1在Curcumin激活Caspase-3过程中起着正向调节作用。为进一步研究DAPK1在这一过程中的作用,我们用Curcumin处理转染si-DAPK1的细胞,结果发现,DAPK1表达沉默的细胞,其G2/M期细胞数目明显降低而G1期细胞数目明显升高(P=0.000),而转染si-Ctrl组的细胞,DAPK1表达水平没有明显变化,细胞的周期分布也没有明显变化。类似地,我们研究发现沉默DAPK1表达抑制Curcumin引起的细胞凋亡(F=637.340,P=0.000)。这些结果表明,DAPK1参与调节Curcumin引起的细胞周期停滞和凋亡。3. Curcumin能够激活胶质母细胞瘤细胞中RANK的表达。我们的研究发现,Curcumin提高了U87和U251细胞中RANK的mRNA表达水平(P=0.000)。同时,30μM Curcumin较15μM Curcumin处理引起了更高的表达水平。Curcumin也提高RANK蛋白水平的表达。由此我们可以推测,Curcumin引起的U251细胞中RANK蛋白水平的升高可能与其mRNA表达增高有关。这些结果说明,Curcumin能够提高胶质母细胞瘤细胞中RANK的表达水平。为鉴定Curcumin引起的胶质母细胞瘤细胞中RANK表达升高是否是由表观遗传修饰的改变引起的,我们首先确定了U251和U87细胞中RANK启动子区的甲基化状态。在U251和U87细胞中,RANK启动子区是高度甲基化的。这一点也被甲基化转移酶DAC处理所证实。为检测前面所观察到的RNAK表达升高是否是由于启动子甲基化状态的改变引起的,我们检测了经Curcumin处理细胞的RANK启动子区甲基化水平。结果显示,它们的甲基化水平发生了翻转,即由高甲基化转变为低甲基化,在凝胶电泳上表示为甲基化条带消失。我们进一步通过对U251细胞RANK基因启动子区域BSP测序验证这一发现。结果证实未经Curcumin处理的细胞表现为高度甲基化,所有检测的17个CpG岛均处于甲基化状态,而Curcumin处理致使这些CpG岛全部非甲基化。这一结果也正与前面观察到的甲基化条带的消失相吻合,进一步证实了Curcumin对CpG岛甲基化状态的翻转作用。我们还验证了Curcumin体外抑制DNMTl analogue M.SssI的作用。结果显示,10μM Curcumin已经能够引起M.SssI活性抑制,但10μM和20μM均不能完全抑制它的活性,而40μM Ccurcumin则会完全抑制M.ssUI的活性。而后,我们研究干扰STAT3表达是否能促进U251细胞中RANK的表达。我们以WB来验证STAT3特异性siRNA转染之后STAT3的抑制情况。我们把STAT3的表达成功抑制,其磷酸化水平也相应降低。在STAT3抑制的细胞中,RANK的表达也发现升高,提示沉默STAT3表达足以引起RANK表达升高。更重要的是,si-STAT3转染的U251细胞中RANK启动子的甲基化状态也发生了改变,由高甲基化状态变为低甲基化状态。不过,在所有检测的17个CpG岛中,只有12个发生了去甲基化,这一转变水平要低于Curcumin处理的细胞。不过,我们的研究结果仍然说明STAT3参与了Curcumin引起的RANK高表达。结论1. Curcumin能够抑制人胶质母细胞瘤细胞增殖,诱导发生G2/M期停滞和凋亡。它对增殖的抑制作用并不依赖对能量代谢的调节；它诱导G2/M期停滞和凋亡与调节细胞周期相关蛋白和BIRC/IAP蛋白表达有关,与调节Akt/FOXO1通路和死亡受体信号通路有关。2. Curcumin能够提高胶质母细胞瘤细胞中DAPK1的表达水平,siRNA转染沉默DAPK1能够减轻Curcumin诱导的胶质母细胞瘤的细胞周期停滞和凋亡也同时能够减轻Curcumin对STAT3和NF-κB的抑制作用以及对Caspase-3的激活作用。3. Curcumin能够通过使启动子区去甲基化提高RANK基因表达。通过siRNA转染抑制STAT3也能改变RANK启动子区的甲基化状态,提高RANK基因的表达。总之,我们的研究揭示了Curcumin对胶质母细胞瘤的增殖抑制作用和凋亡诱导作用,并进一步探讨了Curcumin对抗胶质母细胞瘤的分子机制,新发现了几种参与Curcumin治疗胶质母细胞瘤的分子,为胶质母细胞瘤的治疗增添了新的参考依据。