青果多酚的提取、分离及体外抗氧化活性研究

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多酚是广泛存在于植物中的一类多羟基酚及其衍生物的总称。多酚的邻位酚羟基极易被氧化,对活性氧等自由基也有较强的捕捉能力,因此具有很强的抗氧化活性和清除自由基的能力,能有效预防癌症、心血管疾病和神经组织退化等多种疾病。青果是我国特产,在南方多个省份均有广泛分布,对青果多酚的开发利用具有重要的现实意义。本文主要从以下几个方面对青果多酚进行试验研究:1.以多酚含量和抗氧化活性为指标对青果与其他85种药食两用植物进行比较,对青果多酚与人工合成抗氧化剂BHT的抗氧化活性进行比较。2.选择适合提取青果多酚的溶剂,利用Design-expert软件建立青果多酚的提取模型,并对模型进行验证;3.选择适合纯化青果多酚的大孔吸附树脂,比较不同浓度乙醇洗脱物的抗氧化活性;4.利用不同极性溶剂对青果多酚进行萃取,研究萃取物的纯度和抗氧化活性,确定青果多酚抗氧化活性成分所在的极性区间;5.利用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进一步分离青果多酚,采用高效液相色谱(HPLC)分析青果多酚的组成。6.采用抗氧化活性跟踪法对青果多酚进行研究,研究青果多酚抗氧化活性成分所在的区间及其物质组成。研究结果表明:(1)青果的多酚含量和抗氧化活性均远超其他药食两用植物。青果多酚抗氧化活性优于BHT,对DPPH·的半数清除浓度IC50为0.140mg/mg,为BHT的6.336倍。(2)甲醇、乙醇和丙酮三种溶剂在最适浓度下,对青果多酚的提取能力大小顺序为:甲醇>乙醇>丙酮,试验选择甲醇为提取溶剂。(3)基于星点设计(CCD)青果多酚提取试验结果表明:甲醇浓度(A)、提取温度(B)和提取时间(C)极显著;甲醇浓度平方项(A2)、提取温度(B2)、提取时间(C2)极显著;提取温度与提取时间的交互项(BC)夕极显著,甲醇浓度与提取时间的交互项(AC)显著,甲醇浓度与提取温度的交互项(AB)不显著,各影响因素对于青果多酚提取率的影响不是简单的线性关系。通过Design-Expert软件,建立了以甲醇浓度、提取温度、提取时间为自变量的青果多酚提取模型:Y=0.39+4.883*10-3A+2.514*10-3B+3.064*10-3C-7.919*10-4AB-1.368*10-3AC-1.944*10-3B C-2.419*10-3 A2-1.197*10-3B2-1.298*10-3C2根据此模型得到青果多酚的最佳提取工艺参数为:甲醇浓度为78.2%,提取温度64.4℃,提取时间7.4h;以此条件进行试验,得到提取量平均值为0.3926g/g DM,与模型预测值的提取量值0.3932g/g DM相比,相对误差为1.53%,证明该模型是合适有效的。在该提取模型下得到的青果多酚纯度为62.63%,总抗氧化能力FRAP值为16.15mmol/g,对DPPH·的半数清除浓度IC50为0.140mg/mg。(4)采用乙酸乙酯、正丁醇2种不同极性的溶剂萃取青果粗多酚水溶液,得到乙酸乙酯层(MA)、正丁醇层(MB)、残留水层(MR)3种不同极性萃取层。与粗多酚相比,MA和MB的纯度和抗氧化活性均有了一定的提高,其中,MB的DPPH·清除效果优于人工合成抗氧化剂TBHQ。MA和MB的纯度分别为73.42%和77.05%, MB总抗氧化能力FRAP值为26.97mmol/g,对DPPH·的IC50为0.108mg/mg;MA总抗氧化能力FRAP值为24.25mmol/g,对DPPH·的IC50为0.117mg/mg。(5)AB-8、NKA-9、D4020这3种大孔吸附树脂对青果多酚的静态吸附和洗脱试验结果表明:NKA-9树脂的吸附率和洗脱率分别为为83.79%和84.23%,均高于其它另外的2种树脂,试验选择NKA-9树脂作为多酚纯化用树脂。(6)采用水-乙醇溶液对NKA-9树脂上吸附的青果多酚进行梯度洗脱的结果表明:40%的乙醇洗脱物抗氧化活性最高,其总抗氧化能力FRAP值为29.10mmol/g,对DPPH·的半数清除浓度IC50为0.073mg/mg,纯度可达87.60%。其次,抗氧化活性较强的依次为50%、30%和60%的乙醇洗脱物,30%-60%的乙醇洗脱物DPPH·清除效果均优于抗氧化剂Vc。(7)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20对青果多酚分离效果较好,能得到两个组分F-1、F-2;两组分均具有较强的抗氧化活性。其中,组分F-1的FRAP值为32.57mmol/g,DPPH·的IC50为0.070mg/mg;组分F-2的FRAP值为36.83mmol/g,对DPPH·的IC50为0.058mg/mg。(8)采用外标法对青果多酚进行HPLC分析,结果表明:青果多酚组成复杂,除含有没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芦丁、根皮苷、鞣花酸等9种单体酚外,还含有三种重要的未知物质。在已确定的单体酚中,含量相对较高的为绿原酸、原儿茶酸、没食子酸、鞣花酸。(9)青果多酚抗氧化活性最强的区间为组分F-2,其获得途径为:青果粗多酚经NKA-9大孔树脂吸附,40%乙醇洗脱,然后葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进一步分离。组分F-2的物质组成中能够确定的有:原儿茶酸、绿原酸、香豆酸、阿魏酸、芦丁、根皮苷,其比例分别为:60.21:65.16:3.84:0.45:3.65:1.52;另外尚有几种未确定结构的单体酚,有待进一步研究。
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