禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽类局部或全身性的急性、慢性感染,因其毒力因子的复杂性,给养禽业的发展带来了严重的危害。近年来,人们提出了非编码小RNA(small non-coding regulatory RNA,sRNA),作为一种新发现的基因调节子,其在转录后可水平调节基因的表达。大肠杆菌作为RNA介导调控的模式病原菌,其自身对毒力机制,病原致病机制、代谢途径等已进行了深入研究。RyhB作为目前调控靶mRNA数目最多的小分子RNA之一,鉴于其作为大肠杆菌诸多调控网络的关键组成部分,在细菌的致病过程中发挥着重要作用,但是有关RyhB与禽致病性大肠杆菌致病性及毒力之间的关系却未见报道,因此开展RyhB与APEC致病性之间的关系研究具有重要意义。本研究以sRNA(RyhB)为研究对象,通过构建APEC缺失株△RyhB和基因回复株△RyhB-comp,研究基因缺失对其生物学特性、毒力因子转录水平、黏附CEF细胞能力、半数致死量以及感染雏鸡病理变化的影响,揭示RyhB基因与APEC致病性之间的关系,为进一步研究APEC黏附和侵袭宿主细胞的致病性功能调控通路(Pathway)奠定基础。具体研究内容及结果如下:1、禽致病性大肠杆菌RyhB缺失株及回复株的构建本实验应用Red同源重组技术,通过PCR方法将RyhB-Up、RyhB-Down、PKD3-Cm进行基因扩增,运用overlap的方法,扩增出RyhB同源重组片段,用于打靶目的序列。利用30℃热诱导蛋白,将同源重组片段电转入含PKD46的原始出发株,进行目的基因替换。利用氯霉素抗性标记筛选出阳性转化子,将PCP20质粒电转入阳性菌株消除氯霉素抗性,经PCR验证成功构建出APEC野生株RyhB的缺失株△RyhB。同步经RyhB基因扩增,所得RyhB目的片段和pSTV28载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,然后用T4连接酶连接,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,氯霉素抗性平板筛选阳性克隆。将回复质粒pSTV28-RyhB电击导入△RyhB,经CM抗性筛选获得回复株△RyhB-comp并经PCR验证。2、禽致病性大肠杆菌RyhB缺失株及回复株生物学特性的评价本实验分别从生长曲线、运动性能、活性氧的抑制和禽β-防御素6的耐受实验来研究禽致病性大肠杆菌RyhB缺失后的生物学特性差异。结果显示:APEC缺失株△RyhB以及回复株△RyhB-comp对其生长性能没有显著影响;RyhB的缺失能显著降低AE17的运动性能,构建了回复质粒的△RyhB-comp运动性能有所回复;三株菌对活性氧的耐压性没有明显差异,表明RyhB的缺失不影响APEC对活性氧的耐受性;△RyhB相较AE17,对禽β-防御素6的耐受能力显著性下降,回复株△RyhB-comp的耐受力有所回复。3、禽致病性大肠杆菌RyhB缺失株及回复株对毒力与致病性的分析通过检测毒力基因的转录水平、CEF细胞的黏附力、LD50以及雏鸡病理组织变化来探索APEC RyhB的缺失对其毒力及致病性的影响。结果显示:△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的转录水平均极显著下降(P<0.01),其mRNA转录水平分别约为AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%;△RyhB的iss、ibeA毒力基因表达水平上调分别约为1.14倍和1.2倍。△RyhB黏附细胞能力较AE17均有显著地降低,约为AE17的62.5%,△RyhB-comp相比较△RyhB黏附能力显著上升,为△RyhB的1.4倍。LD50的结果显示,相比AE17,△RyhB的毒力下降了143.5倍,相比△RyhB,△RyhB-comp的毒力有所回复。雏鸡病理学切片观察显示,APEC能引起雏鸡心、肝、脾、小肠组织不同程度的坏死、变性,并伴有充血和淤血。本实验成功构建了APEC的缺失株△RyhB和回复株△RyhB-comp,研究结果表明,RyhB的缺失能引起APEC的运动性能降低、禽β-防御素6耐受性下降,毒力基因的表达水平下调、CEF细胞的黏附力减弱及LD50的下降,推测RyhB对APEC的毒力及致病性具有极其重要的调节作用,为进一步研究RyhB对APEC的致病调控机制提供一些理论参考。