人源金属硫蛋白hMT-I的重组表达及其在乳酸乳球菌的表面展示

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金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸,低分子量的蛋白质,具有结合重金属、清除自由基、抗辐射、抗衰老以及调节微量元素平衡等重要生理功能,在环境保护、医药、食品和农业等领域具有广阔的应用前景。本研究采用乳酸乳球菌N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶Acm A的C端结构域(c A)作为融合标签和锚定功能域,成功地解决了MT蛋白在外源蛋白表达系统中存在的产物稳定性差,表达效率低,产物难以纯化等难题,实现了人源I型金属硫蛋白(h MT-I)在大肠杆菌体系的高效重组表达。构建了一个基于回向锚定技术的表面展示系统,成功将h MT-I在乳酸乳球菌表面进行功能性展示,并对其重金属吸附能力做了相关研究。以乳酸乳球菌MG1363基因组为模板,PCR扩增Acm A基因C末端(c A),与h MT-I基因的5’端融合,连接至大肠杆菌的表达载体p ET21a上。获得重组质粒p ET21a-c A-h MT-I,分别在5’端引入四种促表达标签(A、T、H、P)对重组蛋白的表达量进行优化,表明含H标签的重组蛋白c A-h MT-I的表达效果最好,但是大部分重组蛋白以包涵体形式表达。将五种表达不同分子伴侣的质粒(p G-KJE8、p Gro7、p KJE7、p G-Tf2、p Tf16)转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分子伴侣与重组质粒的共表达,其中与分子伴侣p Tf16系统共表达的的重组蛋白可溶性表达效果最佳,占上清蛋白的39%,达到134 mg/L。以绿色荧光蛋白GFP为报告基因构建乳酸乳球菌表面展示系统。将GFP与c A序列融合,构建重组质粒p ET28a-c A-GFP,转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),通过诱导表达重组蛋白c A-GFP。经SDS-PAGE检测,工程菌表达分子量约53 k D的蛋白质,与预期大小一致。将工程菌超声破碎后的上清液与乳酸乳球菌进行常温孵育,经SDS-PAGE检测和荧光显微镜观察,表明c A-GFP通过回向锚定,成功展示在乳酸乳球菌表面,展示量为121 mg/g干重菌体。GFP锚定至乳酸乳球菌后于4℃保存,放置6天后其荧光活性仍可达82%,表明成功构建了基于回向锚定技术的乳酸乳球菌表面展示系统。以同样的实验步骤处理重组蛋白c A-h MT-I,经蛋白质电泳、ELISA实验检测,表明c A-h MT-I重组蛋白成功展示至乳酸乳球菌表面,展示量为54.16 mg/g干重菌体,且在4℃或者经冷冻冻干保存,均体现出较高的稳定性。表面展示h MT-I蛋白的乳酸乳球菌的重金属(Cd2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+)吸附研究表明,其对Cd2+、Pb2+、Zn2+表现出显著性地吸附,其中对Cd2+的吸附能力最强,Pb2+次之,而对Cu2+的吸附能力较弱。本文建立的金属硫蛋白的高效外源重组功能性表达与乳酸乳球菌表面展示的研究方法具有高效、安全无毒性、成本低和不需纯化等优点,从而为金属硫蛋白的大规模制备以及广泛地应用于食品、化妆品和环境保护等工业领域奠定了基础。
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