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肉毒毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）是目前已知毒性最强的天然物质之一,是一种可致死的毒素。BoNT中毒后会抑制处于神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放,造成肌肉松弛性麻痹。BoNT根据其血清型可以分为A～G 7种血清型。人类中毒是由BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F四种血清型引起的。目前没有有效的小分子药物能够治疗BoNT中毒。本研究的目的是制备BoNT/F的单克隆抗体,为开发BoNT/F的有效治疗药物提供了一定的实验依据。本文通过杂交瘤技术和噬菌体抗体库技术来制备针对于BoNT/F的单克隆抗体。首先,以F型肉毒毒素的重链C端（heavy chain carboxy terminal of BoNT serotype F,BoNT/FHc）蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测3次免疫后的小鼠尾血效价,取尾血效价最高小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞,在聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）的作用下进行细胞融合来制备杂交瘤细胞。细胞融合14 d后,利用间接ELISA筛选能够分泌单克隆抗体的阳性细胞孔。获得阳性细胞后,采用有限稀释法对其进行克隆化。利用试剂盒检测杂交瘤细胞上清中分泌抗体的亚型。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞的方法制备单克隆抗体,并利用protein G柱对腹水中的抗体进行纯化。Lowry法测定抗体的浓度,小鼠中和实验测定单克隆抗体的中和效价。然后,间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清效价最高的单克隆抗体1F4和中和效价最高的单克隆抗体1E2（A）这两株单克隆抗体的亲和力常数。通过IgBLAST分析单克隆抗体的可变区氨基酸序列。采用酶切连接的方式将鼠源抗体1E2（A）的可变区基因连接到人源化质粒中,构建嵌合型人源化质粒。最后,利用噬菌体抗体库来筛选BoNT/F的单克隆抗体。噬菌体抗体库构建完成后,以BoNT/FHc为抗原进行筛选,获得单链抗体片段（single-chain antibody fragment,scFv）基因,并分析其序列。BALB/c小鼠经过抗原BoNT/FHc蛋白3次免疫后,小鼠尾血效价均达到1:16000,2号小鼠的效价最高,达到1:32000。细胞融合率为74.47%,阳性率为8.59%。阳性细胞孔经过克隆化之后获得了7株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株1F4、1E2（A）、4B7（A5）、4B7（B2）、4B7（G3）、1E2（B）、4B7（F1）。7株单克隆抗体的重链均为IgG1型,轻链均为κ型。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）电泳结果表明7株杂交瘤细胞在小鼠腹腔内均产生了抗体,经protein G柱纯化后的抗体纯度均大于90%。Lowry法测定纯化后抗体的浓度分别为2.0 mg/mL、1.8 mg/mL、0.5mg/mL、2.7 mg/mL、2.1 mg/mL、2.5 mg/mL、2.8 mg/mL。动物实验结果表明单克隆抗体的中和效价分别为0 LD50/mg、1200 LD50/mg、0 LD50/mg、200LD50/mg、400 LD50/mg、200 LD50/mg、800 LD50/mg。抗体1F4的亲和力常数为1.08×10-8 mol/L,抗体1E2（A）的亲和力常数为8.45×10-5 mol/L。抗体1F4的轻链可变区CDR3序列为QQHYSTPWT,重链可变区CDR3序列为TRHGYFPSWFAY;抗体1E2（A）的轻链可变区CDR3氨基酸序列和重链可变区CDR3氨基酸序列是保密信息。利用分子生物学的方法成功构建了1E2（A）的嵌合型人源化质粒。提取1号小鼠的脾脏RNA,逆转录成cDNA,扩增出300bp左右的抗体轻重链可变区基因,并通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增出750 bp的scFv序列,获得了库容量为1.2×104的鼠源噬菌体单链抗体库。以BoNT/FHc为抗原对获得的抗体库进行筛选,获得了小鼠重链可变区的FR1序列。本研究最终获得了7株单克隆抗体。抗体1F4的亲和力常数为1.08×10-8mol/L,抗体1E2（A）的中和效价为1200 LD50/mg,这为BoNT/F的检测提供新的方法,也为BoNT/F中毒后的治疗奠定了基础;同时,构建了1E2（A）嵌合型质粒,为1E2（A）的人源化及抗体的表达提供了质粒、序列等相关实验数据。