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脑卒中是全球第二大致死疾病,是我国成年人致死、致残的首要病因,具有发病率高、致残率高、致死率高和复发率高的特点,是严重危害人类健康的疾病之一,其中缺血性脑卒中约占70%。其病理机制十分复杂,包括神经炎症、细胞凋亡、氧化应激等。缺血性卒中发生后大脑内的星形胶质细胞最先受到损伤,释放大量的炎性因子,从而进一步加重脑损伤。大量研究表明抑制星形胶质细胞的炎症反应可能会是未来治疗缺血性卒中的重要途径之一。近些年国内外学者对缺血性脑卒中做了大量深入研究,但仍然缺乏有效的治疗手段。中医药治疗脑卒中具有一定的优势,其药理作用多靶点、多途径性的特点,引起了医学界的广泛关注。中医认为脑卒中(中风)主要是由于阴阳失调、气血逆乱等原因导致的窍闭神昏等症状,治疗当以芳香开窍、醒神回苏为要。麝香是常用的芳香开窍之一,具有改善神经功能缺损、抑制炎症反应、降低脑水肿、特异性开放血脑屏障等药理作用。由于麝科动物是国家一级保护动物,因此临床上天然麝香的使用受到限制。人工麝香作为天然麝香的替代品发挥了极大的作用,但目前人工麝香治疗脑卒中的相关研究较少,其理论机制有待于进一步研究。目的:本研究从抗炎症损伤探讨人工麝香对星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧损伤的保护作用,并以HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路为切入点研究其抗炎作用机制,从而为人工麝香治疗缺血性卒中提供实验依据。方法:1.通过中医传承辅助系统,筛选出《中医方剂大辞典》中使用频次最高的治疗中风的开窍药,并探索其用药规律。2.体外培养原代星形胶质细胞,建立了OGD/R损伤模型。(1)通过免疫荧光法对GFAP染色,鉴定星形胶质细胞阳性率;(2)通过CCK8、LDH、ROS检测试剂盒测定细胞活力、LDH释放量和ROS表达情况以筛选人工麝香的安全剂量和有效作用剂量。3.通过RT-PCR、ELISA方法测定TNF-α、IL-1β、IL-6m RNA的表达以及相应蛋白表达,探讨人工麝香对星形胶质细胞OGD/R损伤后的抗炎作用。4.建立体外HEK 293T细胞转染检测方法,通过双荧光素酶报告法检测人工麝香对NF-κB信号通路的抑制作用。5.通过Western Blotting法分别测定HMGB1蛋白表达量,TLR4信号通路相关蛋白TLR4、TRAF6蛋白表达量,NF-κB信号通路相关蛋白IKKα、IκBα、NF-κBp65的磷酸化水平以及细胞核内NF-κBp65蛋白表达水平;通过免疫荧光法观察OGD/R损伤后星形胶质细胞内NF-κBp65的核移位,探讨OGD/R损伤后人工麝香对星形胶质细胞的抗炎作用机制。结果:1.在《中医方剂大辞典》中治疗中风使用频次最高的开窍药是麝香,与麝香配伍的常用药物有祛风药、活血化瘀药、芳香开窍药、祛痰药、安神药等。2.与Control组相比,0.001-10μg/m L的人工麝香对星形胶质细胞活力无明显影响(P>0.05),100μg/m L浓度的人工麝香能明显降低星形胶质细胞的活力(P<0.001);0.001-1μg/m L的人工麝香对星形胶质细胞的LDH释放无明显影响(P>0.05),10-100μg/m L的人工麝香促进星形胶质细胞的LDH释放(P<0.001)。人工麝香作用于星形胶质细胞的安全剂量范围为0.001-1μg/m L。3.与Control组相比,星形胶质细胞在OGD4 h/R22 h时细胞活力和LDH释放无显著变化(P>0.05);OGD6 h/R18 h细胞活力下降至约60%,LDH释放升高至140%;OGD12 h/R24 h细胞活力下降至46%,LDH释放升高到180%;OGD18 h/R 24 h时,细胞活力下降至30%,LDH释放升高到240%(均P<0.001)。故本实验建立OGD 6 h/R 18h损伤模型。4.与OGD/R组比较,0.01-1μg/m L的人工麝香能够增加OGD/R损伤后星形胶质细胞活力、降低LDH、ROS的释放(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。故本实验选取0.01-1μg/m L作为有效剂量进行后续研究。5.与OGD/R组比较,0.01-1μg/m L的人工麝香能够不同程度的降低OGD/R损伤后星形胶质细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA相对表达量和释放量(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。6.与OGD/R组比较,0.01-10μg/m L的人工麝香能够明显抑制TNF-α诱导的HEK293T细胞内NF-κB信号通路的活性(P<0.001)。7.与OGD/R组比较,0.01-1μg/m L的人工麝香能够降低OGD/R损伤后星形胶质细胞HMGB1、TLR4、TRAF6蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),能够抑制IΚΚα、IκBα、NF-κBp65蛋白磷酸化的水平(P<0.05,P<0.01,P<0.001);还可以抑制星形胶质细细胞在OGD/R损伤后发生的NF-κBp65核移位,降低细胞核内NF-κBp65的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:人工麝香通过抑制星形胶质细胞OGD/R损伤后相关炎性因子的表达和释放,发挥其抗炎作用。人工麝香可降低星形胶质细胞OGD/R损伤后HMGB1、TLR4蛋白的表达,抑制IΚΚα、IκBα、NF-κBp65蛋白磷酸化的水平以及NF-κBp65的核转移,通过调节HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路发挥其神经保护作用。