奇异变形杆菌（proteus mirabilis,PM）是重要的人畜共患病原菌,在自然界分布广泛,常通过食物、水、粪便等途径感染人或动物,可引起食物中毒、腹泻、脑膜炎、中耳炎等疾病。近年来,随着该菌造成的畜禽发病增多和抗生素防控效果的下降亟需开展对该菌的防控研究。生物被膜（Biofilm,BF）是细菌粘附于物质表面,并通过胞外基质包裹,形成具有严密结构性的多细胞群体形态,BF可增加细菌对环境的适用性,其形成受到营养、温度、时间、渗透压等多种因素的调控。此外,密度感应系统（quorum sensing,QS）也是影响细菌生物被膜形成的重要因素。QS是指细菌在环境中达到一定浓度后可通过产生自诱导物（Autoinducer,AI）来调控微生物群体生长状态、运动性、耐药性、BF形成和毒力基因表达等众多生理特征。细菌的LuxS/AI-2型群体感应系统,涉及甲硫氨酸代谢通路,可通过产生AI-2信号分子调控细菌的多种功能。目前已有70余种细菌被发现存在群体感应系统,而禽源PM的LuxS/AI-2型群体感应系统目前尚未见相关研究,探索禽源PM群体感应系统的存在情况以及其采用何种甲硫氨酸代谢通路,可为该菌防控提供新思路。为研究PM在鸡场中的流行特点、PM生物被膜形成规律及群体感应系统类型,开展如下研究:1.鸡源奇异变形杆菌的分子流行病学调查为研究鸡源PM的分子流行病学,本研究从2019～2020年病鸡中分离、鉴定了 52株PM。对分离菌株的致病性、耐药性、毒力因子及生物膜形成等生物学特性进行研究。结果表明,PM分离率为15.29%;对16种抗生素的检测结果表明,52株分离菌株均对克林霉素、阿奇霉素、红霉素、四环素和利福平耐药,多重耐药分析表明:有10株菌对所测16种药物均耐药,有19株菌可产生15重耐药;有23株菌可产生14重耐药,标明分离菌株呈现广泛的耐药性;对PM的13个毒力基因检测表明,所有菌株均能检测到hpmA,hpmB,rpoA,mrpA,fliL,zapA,ureC,atfC,atfA,pmfA,而ucaA和rsbA检出率分别为19.2%（10/52）和48.1%（25/52）,hlyA未检出。本研究结果表明,鸡源PM携带多种毒力基因,耐药模式多样且日趋严重,提示应加强PM在动物致病性和耐药性方面的监控,以降低其感染风险。2.奇异变形杆菌生物被膜形成及影响因素探究为了评价PM分离株的BF形成能力,运用结晶紫染色法对52株PM的生物被膜形成能力进行检测结果表明,所有菌株均能形成中等强度（1.14≤OD<2.28）以上的生物被膜,15.38%（8/52）的分离菌株形成生物被膜能力强（OD≥2.28）,且25℃温度条件下成膜能力更强。为研究培养温度、培养时间、营养条件以及渗透压对PM生物被膜形成的影响,选取BF形成能力强的菌株Prom 34,开展上述条件对其生物被膜形成的影响研究,结果表明,在M9培养基中,分别添加终浓度为0.2%的葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、麦芽糖后,仅在葡萄糖和半乳糖的情况下才能产生BF;而在LB中加入上述浓度和种类的糖,所有组均能产生BF,且各组BF形成能力无显著性差异;不同浓度（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4%）的氯化钠或氯化钾对PM的BF形成影响检测表明,浓度为0.5%和1.0%氯化钠或氯化钾显著促进BF形成（p<0.05）,但随着盐离子浓度增加,PM的BF形成能力降低（p<0.05）。细菌可通过对环境中不同渗透压的适应,调控其生物学功能,为进一步研究不同浓度钠离子对参与PM生物被膜形成的基因转录水平的影响,分别在不添加氯化钠、添加2%氯化钠、添加3%氯化钠的LB培养基中,运用荧光定量PCR检测参与调控PM生物被膜形成的基因（sodB、fi1D、rsbA、umoC、ompF、hfq、luxS、mtnA）,结果表明,除鞭毛转录激活相关的 filD基因分别上调了 1.22、5.95、9.5倍,其余基因（sodB、rsbA、umoC、ompF、hfq、luxS、mtnN）的转录水平变化并不明显,推测在高渗透压环境中,PM可能通过抑制PM鞭毛的转录从而减弱其BF形成。本研究结果表明,分离的鸡源PM菌株均有较高的BF形成能力,在M9培养基中,仅有葡萄糖和半乳糖能显著促进PM生物被膜形成,渗透压影响PM的BF形成。3.奇异变形杆菌LuxS/AI-2型群体感应系统研究LuxS/AI-2型群体感应系统参与调控包括细菌BF形成在内的多种功能,为验证PM中是否存在LuxS/AI-2群体感应系统,本研究运用Vbrio harveyiBB 170生物发光法对PM信号分子AI-2进行检测,结果表明,PM可在胞外可以产生自诱导信号分子AI-2。为探究将PM的luxS和mtnN基因（在大肠杆菌中又称为pfs）是否参与信号分子AI-2的合成,将PM的luxS基因和mtnN分别回补至大肠杆菌DE17的luxS缺失株（DE17ΔluxS）和mtnN基因缺失株（DE17Δpfs）,构建了大肠杆菌异源回补株DE17ΔluxS-PM-luxS和DE17 Δpfs-PM-mtnN,对异源互补株进行AI-2信号分子检测,结果表明,上述互补株均能产生信号分子AI-2,表明PM的luxS和mtnN基因参与信号分子AI-2的合成。为进一步验证PM的luxS和mtnN的体外催化活性,本研究成功构建表达PM 的lux S、mtnN基因的原核表达质粒 pColdI-PM-luxS 和 pCold I-PM-mtnN,转化大肠杆菌,经诱导后成功表达重组PM-LuxS和PM-MtnN。为验证其体外催化活性,将PM-LuxS和PM-MtnN共同催化S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine,SAH）,结果表明,催化 1 mmol 的 SAH 底物,可产生 228.29 μmol的DPD,进一步证明PM的luxS、mtnN基因参与LuxS/AI-2型群体感应系统的调控。本研究结果表明,鸡源PM菌株具有较强生物被膜形成能力,携带多种毒力基因,耐药模式多样且日趋严重,应加强PM在动物致病性和耐药性方面的监控,以降低其感染风险。此外,PM可通过LuxS/AI-2型群体感应系统产生信号分子AI-2,本研究为从群体感应角度开展PM防控提供新思路。