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背景与目的肠杆菌科细菌是引起医院感染最常见的细菌,其中包括肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌以及弗劳地柠檬酸杆菌等。碳青霉烯类抗生素具有良好的抗菌活性,主要针对治疗产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(Ampc酶)等多重耐药菌株引起的感染。但随着临床上对该类抗生素的广泛应用及不合理使用,碳青霉烯类抗生素耐药的菌株日益增多并成流行趋势,需引起广泛关注。目前对于常熟地区耐碳青霉烯类肠杆菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)耐药机制及分子流行病学特点的研究尚未见报道,因此本研究旨在调查常熟地区2016年1月2017年12月耐碳青霉烯类肠杆菌的分离率,并对其耐药谱进行分析,明确该地区CRE的耐药特点及分子流行情况,指导临床合理选择抗生素,制定由CRE引起感染的治疗方案。方法收集常熟市医学检验所2016年1月至2017年12月临床分离的肠杆菌科细菌,利用法国梅里埃Vitek2-Compact全自动分析仪进行菌种鉴定及药敏试验,筛选对亚胺培南、美罗培南、厄他培南任一抗生素耐药的菌株作为研究菌株,采用纸片法(K-B法)对这些菌株的耐药性做进一步验证。通过聚合酶链反应法(PCR)筛选编码碳青霉烯酶的耐药基因,研究其耐药相关机制,耐药基因包括blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48,同时还检测了编码多粘菌素耐药基因mcr-1基因。采用质粒接合转移试验研究携带碳青霉烯酶基因的质粒的水平转移机制。通过脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)以及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)对常熟地区耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分子流行病学进行研究。结果2016年1月至2017年12月常熟医学检验所共筛选出51株非重复耐碳青霉烯类肠杆菌。其中肺炎克雷伯菌34株,大肠埃希菌8株,粘质沙雷菌5株,阴沟肠杆菌1株,费劳地枸橼酸杆菌1株,产酸克雷伯菌1株,雷氏普罗威登菌1株。细菌检出以痰液和血液为主,各占41.2%(21/51)和27.5%(14/51)。菌株科室来源主要集中在急诊科、神经外科、重症医学科,依次为31.4%(16/51)、31.4%(16/51)、23.6%(12/51)。药敏结果显示,51株肠杆菌科细菌对亚胺培南和美罗培南耐药率均为100%,对头孢菌素类,β-内酰胺类,喹诺酮类抗菌药物耐药率都超过90%。对氨基糖苷类耐药率稍低,其中对庆大霉素耐药率为88.2%,对丁胺卡那耐药率为79.2%,对替加环素暂时未出现耐药。PCR结果显示,碳青霉烯酶阳性菌株共42株,检出率为82.3%(42/51)。其中34 株携带 blaKPC-2(66.7%),7 株携带blaNDM-1(13.7%),3 株携带blaIMP-4(5.9%),其中有两株同时携带blaKPC-2和blaNDM-1(CS13和CS14)。所有被测菌株的耐药基因blaVIM、blaOXA-48及编码多粘菌素耐药基因mcr-1均为阴性。对42株携带碳青霉烯酶基因的菌株进行接合转移试验,其中31株携带KPC-2的耐药菌株在选择平板上成功获得转移接合子,药敏试验及接合成功率73.8%,但10株携带blaNDM和blaIMP基因的菌株均未能从供体菌转移至受体菌。34株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌PFGE分型共得到11种分型A-K,主要为A型和B型共24株,A型为15株(其中12株分离自常熟市第一人民医院急诊科),B型为9株(6株分离自常熟第二人民医院神经外科),C型为2株,其余各型D-K分型各1株。MLST分析显示,肺炎克雷伯菌的优势克隆型为ST11,有34株占100%(34/34),其中PFGE的2种主要型别均属于ST11。结论1.目前常熟地区耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)以肺炎克雷伯菌为主,产blaKPC-2型碳青霉烯酶是主要的耐药机制,由质粒介导的水平传播在blaKPC-2的播散中可能起重要作用。2.常熟地区耐碳青霉烯类肠杆菌对临床常见抗菌药物耐药情况严重,多数为多重耐药菌,对替加环素暂时未出现耐药。3.常熟地区目前CRKP流行的克隆株主要为A型和B型,存在小范围传播,主要局限在个别医院的急诊科及神经外科,暂时未出现同一克隆群的跨医院传播。4.ST11是目前常熟地区CRKP主要流行的ST型,这与国内主要流行的克隆型一致。