论文部分内容阅读
目的:流行病学调查提示,孕期不良环境暴露的子代成年时期高胆固醇血症易感,并具有宫内起源。地塞米松作为一种人工合成的糖皮质激素,可治疗早产及相关妊娠疾病,因此广泛于产前使用。流行病学调查提示,产前地塞米松滥用将导致子代成年疾病易感,如肥胖、神经系统、骨关节炎和代谢综合征等。虽然已有动物研究发现,孕期地塞米松暴露(prenatal dexamethasone exposure,PDE)可致子代出生后血胆固醇水平升高,但未深入研究其是否具有宫内起源以及其宫内编程机制。本研究旨在证实PDE所致的雄性大鼠成年子代高胆固醇血症,并阐明其宫内表观遗传编程机制。方法:Wistar大鼠受孕分为四组:正常对照组和地塞米松小、中、大剂量组[即PDE(S)、PDE(M)、PDE(H)]。于孕9-21天(gestational day 9-21,GD9-21)经颈部皮下注射不同剂量(0、0.1、0.2和0.4 mg/kg·d)的地塞米松,部分孕鼠于GD21经麻醉处死,取血和胎肝组织,另一部分经自然分娩于出生后12周(postnatal week 12,PW12)和PW28处死,取血和肝脏组织,母系遗传的F2代与F3代雄性大鼠在PW12周处死,取血和肝脏组织。通过生化试剂酶法测定出生前、后血胆固醇水平。通过q RT-PCR和Western blotting技术检测多代肝组织多种胆固醇代谢相关基因的表达,包括糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGCR)、载脂蛋白B(apolipoprotein B,Apo B)、清道夫受体B1(scavenger receptor B1,SR-B1)、低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor,LDLR)、Di George综合症关键区域基因8(Di George syndrome critical region 8 gene,DGCR8)、RNA酶基解旋酶(helicase with RNase motif,Dicer)和2类核糖核酸酶III酶(Class 2 ribonuclease III enzyme,Drosha)。通过染色质免疫共沉淀技术检测GR对DGCR8启动子区域的增强转录调控。通过提总RNA后的对mi RNA进行分离和检测来筛选表观遗传调控机制。同时应用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)肝样分化细胞模型,探索地塞米松对发育分化过程中肝细胞的影响,并在其BMSCs肝样分化细胞和肝传代细胞系上,验证地塞米松对胆固醇相关代谢基因表达的影响及其调控LDLR的表观遗传机制。结果:宫内时期:与正常对照组相比,PDE组雄性胎鼠血总胆固醇(total cholesterol,TCH)水平呈剂量依赖性降低(P<0.05),而HDL-C和LDL-C水平出现明显降低(P<0.05)。进一步发现,胎鼠肝脏TCH含量呈剂量依赖性降低(P<0.05,P<0.01),同时胆固醇代谢相关基因(HMGCR、Apo B、SR-B1、LDLR)的m RNA及蛋白表达在PDE(M)、PDE(H)组均降低(P<0.05)。与正常对照组相比,PDE组胎肝GR的m RNA表达增加,同时胎肝胞核蛋白GR的表达增加(P<0.01)。胎肝中mi RNA合成识别酶DGCR8和mi RNA剪切酶Dicer的m RNA表达水平显著性升高(P<0.05),mi R-148a表达水平显著升高(P<0.05)。出生后:与正常对照组相比,PDE(M)组雄性子代大鼠PD1体重显著降低(P<0.05,P<0.01),而在PW2～PW6体重显著升高,PW7～PW 12接近正常对照组,而PD1-PW12的体重增长率一直显著高于正常对照组(P<0.01)。之后,我们检测了血清胆固醇水平变化,与正常对照组相比,PDE组PW12与PW28的血清TCH水平均升高(P<0.05,P<0.01),而HDL-C水平在PW12升高而在PW28降低(P<0.05,P<0.01),LDL-C水平在PW12无明显变化但在PW28有升高趋势(P=0.055)。结果进一步显示,PDE组PW12和PW28的血TCH/HDL-C和LDL-C/HDL-C的比值均升高(P<0.05)。结果显示,PW12和PW28肝组织TCH含量增加(P<0.05)。在PW12,PDE组肝脏胆固醇输出基因Apo B的m RNA及蛋白水平增高(P<0.05),胆固醇逆转运功能基因SR-B1、LDLR的m RNA及蛋白水平降低(P<0.05),而胆固醇合成功能基因HMGCR的m RNA及蛋白水平无明显变化。在PW28,PDE组肝脏HMGCR、Apo B、LDLR的m RNA及蛋白水平均降低(P<0.05,P<0.01),而SR-B1的m RNA及蛋白水平升高(P<0.05,)。在多代研究中发现,与正常对照组相比,F2代PDE组成年大鼠血清TCH水平、肝mi R-148a表达和LDLR m RNA表达均无显著改变,仅SR-B1的m RNA水平显著增加(P<0.05);而F3代PDE组成年雄性大鼠血清TCH水平增加,肝脏mi R-148a表达增加而LDLR的m RNA表达降低(P<0.05,P<0.01)。细胞实验:通过Dil-AC-LDL检测和PAS染色发现,BMSCs分化后的肝样细胞内出现低密度脂蛋白、糖原和ALB的聚集,流式细胞术鉴定ALB标记的细胞比例93.8%,CK18标记的细胞比例84.2%。提示,BMSCs肝样细胞分化成功。在BMSCs肝样细胞发现,地塞米松处理细胞后,培养基上清中TCH水平不仅呈时间依赖性升高(P<0.01),而且呈浓度依赖性升高(P<0.05,P<0.01)。同时GR的下游靶基因血清糖皮质激素调节酶1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1,Sgk1)呈浓度依赖性升高(P<0.01),表明GR处于激活状态。进一步发现,DGCR8、Dicer和mi R-148a的表达均呈浓度依赖性升高(P<0.05,P<0.01),LDLR的m RNA与蛋白水平表达呈浓度依赖性降低(P<0.05,P<0.01)。在Hep G2细胞上进行LDLR、mi R-148a和GR干扰发现,地塞米松可以明显升高细胞外高胆固醇环境中细胞内、外胆固醇含量(P<0.01),而过表达LDLR可逆转地塞米松所致的细胞外胆固醇含量升高(P<0.01),并促使细胞内的胆固醇含量进一步升高(P<0.05)。mi R-148a抑制剂可显著逆转地塞米松所致的LDLR表达降低(P<0.05,P<0.01),还可以一定程度的逆转地塞米松所致的细胞外胆固醇含量升高,并且使转运至细胞内胆固醇含量增多(P<0.05,P<0.01)。GR抑制剂RU486可以显著逆转地塞米松所致DGCR8和mi R-148a的m RNA表达升高、LDLR的m RNA及蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。此外,在Hep G2细胞上进行Ch IP-PCR检测,证实地塞米松处理后DGCR8启动子区与GR结合增多(P<0.01)。结论:PDE可致雄性成年子代大鼠高胆固醇血症,其发生主要是宫内地塞米松通过活化肝脏GR,增强DGCR8和mi R-148a表达,而mi R-148a的高表达可从宫内延续至成年甚至F3代,编程了肝脏LDLR的持续低表达量,导致胆固醇逆转运功能受损,最终导致高胆固醇血症的发生。