刺参具有较高的营养和保健价值,被列为“海产八珍”之一,近年来,随着我国经济的发展和国民消费水平的提高,刺参产品市场需求不断增加。刺参的增养殖也随之得到迅速发展,与此同时,近年来刺参病害的大规模爆发对其养殖产业造成了严重威胁,且近年来气候变化带来的极端高温天气造成山东、辽宁等大面积养殖池塘刺参大量死亡损失,对沿海刺参养殖产业带来沉重打击。因此,研究高温胁迫对刺参的影响以及刺参对高温胁迫产生的应答反应机制,为高温环境下刺参养殖提出有效方法,对水产养殖产业健康具有十分重要的意义。探究刺参抗逆机理是解决刺参健康养殖和安全度夏瓶颈问题的重要出路,刺参健康关乎整个水产养殖业的提质增效和稳定发展。因此,深入研究刺参的抗逆抗病机制已成为当前刺参养殖产业研究中的热点。本研究以刺参（Apostichopus japonicus）为研究对象,从高温应答重要功能基因入手,一方面以存在于胞液中σ-谷胱甘肽S转移酶2基因为代表,研究其表达规律以及对其进行活性功能研究,从刺参机体防御免疫体系角度探讨刺参响应温度变化;另一方面围绕内质网应激,对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡过程中的重要代表基因钙联蛋白基因、葡萄糖调节蛋白78基因和钙周期素结合蛋白基因进行表达规律和相互关系的研究,从生物高温应激角度探讨刺参响应温度变化。研究克隆了刺参σ-类谷胱甘肽S转移酶2（σ-class glutathione-s-transferase 2）基因、钙联蛋白（calnexin）基因、葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78 kD）基因和钙周期素结合蛋白（calcyclin-binding protein）基因的完整编码区cDNA序列,采用荧光定量PCR技术研究了以上4个基因组织表达情况;分析在温度变化后刺参各组织中各基因的表达规律,在此基础上探究刺参各组织高温胁迫的分子调控机理;此外,纯化出了刺参σ-谷胱甘肽S转移酶2基因的蛋白,并对其纯化后的蛋白活性进行了验证。主要研究结果如下:1刺参σ-类谷胱甘肽S转移酶2（σ-GST2）基因克隆、表达分析和功能研究克隆获得刺参σ-GST2开放阅读框cDNA的编码序列。σ-GST2 ORF长度为627bp。σ-GST氨基酸序列具有N端结构域（4-73）和C端结构域（84-202）两个保守区域。与其同源物种比对氨基酸序列同源性约为54%。所有比对物种GST的N端区域高度保守,而C端区域则相对多样化。系统发育树分析表明刺参σ-GST2与海葵亲缘关系最近,与贝类动物长牡蛎和三角帆蚌等聚成一簇。荧光定量PCR技术分析表明经高温胁迫处理后,呼吸树、纵肌、体壁均在30℃开始出现显著高表达,而消化道在34℃出现显著高表达。高温胁迫均能促进σ-GST2基因在所有组织中的表达。另外,构建原核表达载体后经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果发现与对照组相比,诱导组在Marker 25KDa附近靠下处有明显的一条带。分子量大小与预测大小23.51KDa相符,表明成功诱导出σ-GST2蛋白。纯化蛋白过程中留样上清及沉淀进行SDS-PAGE,结果表明目的蛋白主要表达在上清中。将所有经Ni柱纯化过程中的留样样品进行SDS-PAGE检测。获得超滤后的蛋白含量最高,且最终获得纯化蛋白纯度>95%。测定了未纯化的上清和纯化超滤后蛋白浓度分别为2.647和3.540μg/ul。由公式计算出酶活分别为:初上清样的酶活为0.669（U/mg prot）,超滤后样品的酶活为1.449（U/mg prot）。可见纯化超滤后的酶活性更高。2刺参钙联蛋白（Cnx）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和钙周期素结合蛋白（CacyBP）基因克隆及表达分析本研究克隆获得刺参Cnx、GRP78和CacyBP开放阅读框cDNA的编码序列。并分别预测了它们编码的氨基酸序列和蛋白分子质量以及理论PI值。另外分别对它们做了同源序列比对分析以及构建了系统发育树。Cnx氨基酸序列在N端含有一个由20个氨基酸残基组成的信号序列。氨基酸多序列比对结果表明刺参Cnx氨基酸序列与其他已知物种同源物的氨基酸序列同源性约为56%,所有比对物种Calreticulin结构域均高度保守,系统发育树分析表明刺参Cnx与棘皮类海星Acanthaster planci亲缘关系最近;刺参GRP78氨基酸序列与其他已知物种同源物的氨基酸序列同源性约为83%,所有比对物种C端HSP70结构域高度保守,而N端结构域是多变的,刺参GRP78与海绵Amphimedon queenslandica亲缘关系最近;刺参CacyBP氨基酸序列与其他已知物种同源物的氨基酸序列同源性约为66%,BLAST分析表明,刺参CacyBP与脊椎动物鲱鱼Denticeps clupeoides和棘皮动物海星Acanthaster planci同源性最高,相似度高达86.79%和85.96%。进化树分析表明刺参CacyBP与海星Acanthaster planci亲缘关系最近,其次是文昌鱼。此外,利用荧光定量PCR技术分析了Cnx、GRP78和CacyBP基因在刺参经不同温度胁迫下不同组织中的表达规律。刺参Cnx、GRP78和CacyBP均广泛分布于呼吸树、消化道、纵肌和体壁。急性升温中Cnx、GRP78和CacyBP在所有组织中的表达水平在18℃、22℃和26℃都很稳定,没有明显的上升情况。急性升温到34℃时,消化道组织GRP78和CacyBP相对表达量最高,并且从22℃开始升温到34℃,CacyBP基因在消化道的表达水平较其他组织一直呈现相对最高表达量。这说明消化道是刺参强大的组织器官,参与热应激反应更为明显,以上三个基因在刺参高温胁迫过程中对抵抗内质网应激产生的不良刺激以及维持内质网稳态发挥重要作用。本研究也构建了CacyBP原核表达载体后经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果发现与对照组相比,诱导组在Marker 15KDa附近靠下处有明显的一条带。分子量大小与预测大小14KDa相符,表明成功诱导出CacyBP蛋白。