花鲈维氏气单胞菌致病性分析及灭活疫苗和中草药效果评价

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维氏气单胞菌是花鲈养殖中主要病原菌之一,可引发细菌性败血症,主要表现为腹腔充血、出血,脾脏和肾脏等器官发生病变,给花鲈造成一定的危害。目前,鱼用疫苗和中草药物是防控水产细菌性病害的重要途径。本研究针对花鲈维氏气单胞菌的致病性进行探究,并通过制备单价/二价灭活维氏气单胞菌疫苗与中草药水提物,分析鱼用疫苗与中草药物对维氏气单胞菌的抗菌效果,旨为维氏气单胞菌防控提供理论支持。(1)本研究对所分离的维氏气单胞菌进行毒力筛选,维氏气单胞菌18BJ181对花鲈呈现強毒力,生理生化实验显示,18BJ181对O/129耐受性、β-半乳糖苷酶等16种生理生化反应为阳性。该菌在p H为7-9时,生长良好,对阿莫西林、麦迪霉素、青霉素与磺胺甲恶唑产生耐药反应,携带气溶素(aer)、细胞肠毒素(act)、甘油磷脂-胆固醇酰基转移酶(gca T)、IV型菌毛(tap A)和鞭毛蛋白(fla)5种毒力基因。18BJ181人工感染花鲈引起花鲈在24 h内急性死亡,并伴有腹腔出血,肛门红肿,肾脏和肝脏出血与充血,脾脏发生肿胀;组织病理学显示,该菌株可引起花鲈心肌细胞出血、肌纤维水肿断裂,肝细胞脂肪变性、出血和充血,肾小管上皮细胞坏死脱落,间质组织出血;脾脏中发现炎性细胞浸润。菌载量实验表明,在感染8 h,维氏气单胞菌在脾脏和肝脏中的量达到峰值,感染12 h和24 h后,分别在血液和肾脏中达到峰值。腹腔注射和肌肉注射的半数致死量(LD50)分别为8.5×105cfu·g-1和4.2×105cfu·g-1。(2)针对维氏气单胞菌18BJ181所致花鲈急性死亡现象进行解析。18BJ181感染花鲈1 h后,花鲈开始死亡,2-12 h花鲈均发生不同程度死亡情况。研究发现感染后8 h引起花鲈腹腔严重积水与出血,脾脏发黑,出血,造血组织等发生变性坏死;24 h出血较轻,脾脏呈暗红色,肾脏肿大,含铁血黄素沉积。转录组学揭示,维氏气单胞菌18BJ181感染花鲈后,8 h组有2665个DEGs上调,2242个DEGs下调;24 h组有1102个DEGs上调,984个DEGs下调。经GO和KEGG富集分析发现与免疫通路相关的富集数目最多的差异表达基因包括Chemokine信号通路和NOD-样受体信号通路。(3)制备维氏气单胞菌强毒株18BJ181和18QW235单价甲醛灭活疫苗,以甲醛终浓度0.2%灭活48 h后的单价灭活疫苗具有一定的安全性,其血清中同型之间抗体凝集效价最高可达1:480,异型之间抗体凝集效果较差,最高为1:192,血清中酸性磷酸酶(ACP)和丙二醛(MDA)等相关酶活力在不同时间上发生不同的变化,血液中呼吸爆发能力显著性增强(P<0.05)。免疫28 d后攻毒发现维氏气单胞菌单价灭活疫苗同型之间相对保护力分别为92.3%与53.6%,异型之间相对保护力较差。基于此研究,构建不同体积比(1:1,1:2和2:1)的维氏气单胞菌18BJ181和18QW235二价灭活疫苗,以终浓度0.5%,灭活24 h后免疫后10 d对花鲈能产生免疫应答,免疫持续期可达56 d,不同体积配比的维氏气单胞菌二价灭活疫苗——F18BJ181和F18QW235在不同时间(10 d、28 d和56 d)对两种维氏气单胞菌(18BJ181和18QW235)具有不同的免疫保护效果;黏液中ACP、AKP、LZM和SOD在免疫21 d及以后发生显著性增强(P<0.05)。在免疫49 d后,血清中Ig M含量与对照组一致,乳酸脱氢酶(LDH)含量显著性降低(P<0.05)。为结合疫苗批量生产步骤,优化制备流程,本研究制备维氏气单胞菌(含胞外产物)二价灭活疫苗,并在免疫10 d后发现其免疫保护效果优于无胞外产物二价灭活疫苗,最高的相对保护力达96%;血清中Ig M含量与高密度脂蛋白(HDL)含量显著性降低(P<0.05),LDH含量显著性升高(P<0.05)。经疫苗储存期测定维氏气单胞菌灭活疫苗可以在4℃条件下至少储存4个月,具有较好的保质期。(4)体外筛选82味价廉中草药,制备单方和复方中草药水提液。药敏实验发现,36味中草药对维氏气单胞菌18BJ181有抑制作用,其中乌梅(Prunus mume)和苏木(Caesalpinia sappan)等5味单味中草药对维氏气单胞菌有较强的体外抑菌作用,抑菌圈直径介于15~25 mm之间,MIC<125 mg·m L-1,且MBC<500 mg·m L-1。复方中草药体外抑菌实验显示,乌梅+丁香和乌梅+五倍子复方对18BJ181体外抑菌作用较好,抑菌圈直径>19 mm,MIC为15.6 mg·m L-1,MBC介于31.25~62.5mg·m L-1,联合抑菌指数分析表明,它们呈现无关作用。选取乌梅、苏木和金银花(Lonicera japonica)评价中草药对花鲈体内安全性和抗维氏气单胞菌作用,灌胃实验结果发现,苏木和金银花水提液对花鲈具有良好的安全性,但体内抗菌效果较低。本研究分别通过人工感染、病理学和转录组学等多角度解析维氏气单胞菌对花鲈的致病性,并制备维氏气单胞菌单价/二价灭活疫苗和中草药水提物,评价其对花鲈维氏气单胞菌防控作用,为花鲈养殖病害研究奠定基础。
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