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口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、高度接触性传染病，造成了巨大的经济损失，传统的口蹄疫灭活疫苗，能够诱导产生中和抗体、保护动物免受FMDV的攻击，在口蹄疫的控制和清除过程中起着重要的作用.然而，传统的灭活疫苗需要增殖和灭活病毒，这就需要必须的设备条件而存在着病毒逃逸和灭活不彻底的危险性，存在着明显的生物安全问题，因此研究新型的疫苗控制该病显得尤为重要.FMDV属微RNA病毒科口蹄疫病毒属.FMDV完整的病毒颗粒由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝构成的衣壳包裹一条单股正链RNA组成。大量的研究表明VP1上含有很多B细胞和T细胞表位，能够诱导实验动物和自然宿主产生中和抗体，是FMDV主要的抗原蛋白.但是，VP1通过不同的表达系统表达只能产生低水平的中和抗体和较低的保护力。
本研究首次设计构建了猪0型口蹄疫病毒多表位VPe蛋白(VP1上的(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨基酸)、VP1蛋白分别与猪α干扰素、猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GMCSF串联融合表达的重组腺病毒(rAd-pIFNα-VPe、rAd-pIFNα-VP1、rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1).首先在小鼠上测定了这几株重组腺病毒诱导的免疫应答能力，然后在豚鼠和猪体上衡量了其免疫攻毒保护力.研究结果证实pIFNα和GMCSF对FMDV的VP1抗原有明显的免疫增强作用。
本研究内容分为以下5个部分：
1.0型FMDV VP1蛋白的原核表达与鉴定
利用RT-PCR扩增得到VP1蛋白基因并克隆入原核表达载体pET32a(+)，构建重组表达质粒pET32a(+)-YP1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达，并用镍柱亲和层析法获得了纯化蛋白，用猪0型FMDV标准阳性血清和VP1的单抗进行Western-blot和iELISA检测，证明该目的蛋白具有FMDV VP1蛋白的抗原性，该重组VP1蛋白的成功表达与鉴定为FMDV免疫血清学抗体检测奠定了基础。
2.猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究
利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-pIFNα，经Pacl酶切后转染HEK-293A细胞，3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-pIFNα.该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定，为1010.0TCID50/mL.RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达；在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性，从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。
3.串联表达猪α干扰素与FMDV VP1蛋白的重组腺病毒的构建与免疫特性研究
将编码猪α干扰素成熟蛋白和FMDV VP1蛋白的基因分别插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，构建了串联表达pIFNα与FMDV VP1蛋白的重组腺病毒，在小鼠上测定了其免疫原性。第1-3组BALB/c小鼠分别皮下免疫rAd-VP1、rAd-pIFNα+rAd-YP1和rAd-pIFNa-VP1，笫4-6组分别免疫rAd-pIFNα、野生型腺病毒(wtAd)和PBS作为对照，间隔2周加强免疫1次。结果表明，免疫rAd-pIFNα-VP1的小鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答水平明显高于rAd-pIFNα+rAd-VP1免疫组(P<0.05).4组豚鼠分别后腿肌肉注射rAd-pIFNα-VP1、灭活苗、wtAd和PBS，间隔2周加强免疫1次.结果表明，虽然rAd-pIFNα-VP1免疫组的中和抗体水平(1:32-1:40)低于灭活苗免疫组(1:64-1:128)，但是rAd-pIFNα-VP1免疫组和灭活苗免疫组的所有豚鼠都能够抵抗口蹄疫病毒的攻击.该重组腺病毒rAd-pIFNα-VP1的成功构建为口蹄疫基因工程疫苗的研究奠定了基础.
4.串联表达猪α干扰素与FMDV VP1多表位抗原的重组腺病毒的构建与免疫保护作用研究
选取FMDV VP1上的(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨基酸(为FMDV的T细胞和B细胞表位)，设计了FMDV多抗原表位的目的蛋白(VPe)基因，构建了串联融合表达口蹄疫病毒多表位(VPe)与pIFNα的重组腺病毒rAd-pIFNα-VPe，在小鼠上测定了其免疫原性.6组BALB/c小鼠间隔2周皮下免疫两次，测定其体液免疫和细胞免疫水平.然后在豚鼠和猪上做了攻毒保护试验检测了rAd-pIFNα-VPe的免疫保护力.结果表明，免疫rAd-VPe的小鼠能够产生针对FMDV的特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答，并且这种免疫应答在联合注射rAd-pIFNα+rAd-VPe的免疫组得到了加强.更为重要的是，免疫rAd-pIFNα-VPe的小鼠的免疫应答水平明显高于rAd-pIFNα+rAd-VPe免疫组(P<0.05).免疫rAd-pIFNα-VPe的所有豚鼠和猪都能够抵抗口蹄疫病毒的攻击.该结果表明，rAd-pIFNα-VPe有可能成为预防口蹄疫病毒感染的疫苗候选分子。
5.串联表达猪GMCSF与VPe或VP1的重组腺病毒的构建与免疫特性研究
利用RT-PCR扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)成熟蛋白的基因后，按正确的阅读框与口蹄疫病毒多表位VPe蛋白或者VP1蛋白的基因串联，成功构建了穿梭载体pShuttle-CMV-GMCSF-VPe和pShuttle-CMV-GMCSF-VP1，经酶切、测序鉴定正确。Pmel酶切线性化后在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组，产生重组腺病毒DNA。将重组腺病毒DNA经PacI酶切线性化后通过脂质体法转染HEK-293A细胞，在细胞内包装成完整的腺病毒。通过骨髓细胞增殖试验和Western-blot可以检测到这两株重组腺病毒(rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1)可以正确表达目的蛋白。
利用BALB/c小鼠进行免疫试验，测定其诱导的体液免疫和细胞免疫水平.然后在豚鼠和猪上进行攻毒保护试验，检测了其免疫保护力，结果表明，免疫串联表达融合蛋白GMCSF-VPe的重组腺病毒rAd-GMCSF-VPe的小鼠产生了最高水平的FMDV特异性的T淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-4；免疫串联表达融合蛋白GMCSF-VP1的重组腺病毒rAd-GMCSF-VP1的小鼠产生了最高水平的FMDV特异性的体液免疫应答.联合应用rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1(rAd-GMCSF-VPe+rAd-GMCSF-VP1)免疫豚鼠和猪，两次免疫后中和抗体水平低于灭活苗免疫组(P<0.05)，但联合免疫的所有动物均可抵抗FMDV强毒的攻击.该研究表明，联合应用重组腺病毒rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1可能成为预防口蹄疫病毒感染的免疫策略。
综上所述，FMDV多表位VPe蛋白或VP1蛋白与pIFNα或GMCSF融合表达后，能明显提高其诱导的中和抗体水平和细胞免疫应答，免疫rAd-pIFNα-VPe或者联合应用rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1(rAd-GMCSF-VPe+rAd-GMCSF-VP1)的所有豚鼠和猪都能够抵抗口蹄疫病毒的攻击，获得全部的保护，从而为猪0型FMD重组腺病毒疫苗研究奠定了基础，为研究安全有效的FMD新型疫苗提供了新的思路和方法。