论文部分内容阅读
化学农药在保护农业生产、提高产量等方面发挥着重要作用。但是,最近半个世纪,越来越多的农药被证实可能存在环境内分泌干扰效应。它们通过干扰生物体正常激素调节,引起机体内神经系统、分泌系统、免疫系统产生诸如雄性退化,雌雄同体,种群退化等问题。戊唑醇(Tebuconazole)是一种广谱、高效的内吸性三唑类杀菌剂,其低毒高效的特点使其被全世界广泛使用。随着戊唑醇杀菌剂的广泛使用,其对我国生态环境的影响应引起高度重视。相关研究已表明戊唑醇会对斑马鱼造成生殖内分泌干扰效应,但其具体干扰机制尚未清楚。因此,本课题拟展开戊唑醇对cAMP/PKA/SF-1信号转导干扰机制的相关研究。(1)为筛选戊唑醇体外实验具体暴露时间及暴露浓度,首先选择0-72h间11个时间点,通过细胞计数法,选择人源H295R细胞生长对数生长期的时期,确定戊唑醇暴露时间为48 h。同时通过MTS试剂盒及ATP试剂盒,检测0.1 mg/L-50 mg/L范围戊唑醇暴露48 h后H295R细胞的活力。MTS及ATP结果表明,在20mg/L浓度下,细胞活力为对照80%左右。最终选择48h,戊唑醇暴露浓度为20 mg/L作为后续体外实验暴露标准。(2)将经戊唑醇20 mg/L,暴露48 h的H295R细胞与未暴露H295R细胞进行转录组测序。测序结果表明,对比空白对照,戊唑醇处理组共有165个基因存在显著差异,其中102个基因显著性上调,63个基因显著性下调。KEGG富集分析结果显示与cAMP/PKA/SF-1通路相关的Ras signalingpathway、PI3K-AKT signaling pathway 及Rap1 signaling pathway等通路受显著干扰。(3)通过RT-PCR、PKAKit、蛋白免疫印迹等实验方法,采取体外实验结合体内实验方式进一步研究戊唑醇对cAMP/PKA/SF-1信号转导通路的影响。PKA试剂盒测定结果表明,20 mg/L戊唑醇暴露H295R细胞及0.5 mg/L戊唑醇暴露斑马鱼胚胎后,造成其体内PKA活力显著性降低。WB实验表明,在体内实验中,戊唑醇暴露会导致斑马鱼胚胎体内Phosphoserine、Phosphothreonine及Phosphotyrosine蛋白表达量降低;H295R细胞暴露实验中,戊唑醇暴露会导致H295R细胞Phosphothreonine蛋白表达量降低,H-89作为PKA抑制剂会产生与戊唑醇相同效果,毛喉素作为PKA激动剂则能缓解戊唑醇的影响。通过RT-PCR实验探究戊唑醇对SF-1通路相关基因的影响,戊唑醇暴露48h,H295R细胞内ERα、SF-1、GPR30、ERβ、CYP17基因表达量显著下降,H-89暴露产生与戊唑醇相近效果,毛喉素暴露能缓解戊唑醇对SF-1通路基因的影响。(4)实验成功通过CRISPR-Cas9方法,构建△YAK1 H295R细胞株,使PKA过量表达,用于进一步验证戊唑醇对cAMP/PKA/SF-1信号通路的影响。同样采取PKAKit、蛋白免疫印迹、RT-PCR方式验证。PKAKit及蛋白免疫印迹实验结果与体外实验暴露H295R细胞及体内实验暴露斑马鱼胚胎一致,进一步验证了戊唑醇对该通路的影响。△YAK1 H295R的RT-PCR结果表明,H295R细胞作为阴性对照,其ERβ、GPR30、CYP17基因表达较△YAK1 H295R细胞显著下降;此外,20 mg/L戊唑醇暴露会导致△YAK1 H295R细胞ERα、SF-1、CYP450、ERβ、GPR30、CYP17、GPER基因表达显著下调,与H295R的RT-PCR结果一致。(5)为探究戊唑醇是否通过结合PKA方式对cAMP/PKA/SF-1信号转导通路造成影响,采取表面等离子共振(SPR)方式,探究戊唑醇与hPKA-Ca的结合。在戊唑醇与hPKA-Ca的结合实验中,180s进样后不同浓度戊唑醇的结合响应值分别为27.6 Ru(0.2μM)、、34.1 Ru(0.4μM)、37.7 Ru(0.8μM)、43.6 Ru(1.6μM)、54.4 Ru(3.2μM)、66.2 Ru(6.4μM)、75.8Ru(12.5μM)、106.2 Ru(25μM),戊唑醇与hPKA-Ca的结合(Ru)随着戊唑醇浓度升高而升高,动力学常数KD为2.72×10-7;在阳性对照H-89与hPKA-Ca结合实验中,180s进样后不同浓度H-89的结合响应值分别为93.6Ru(0.32μM)、110.1 Ru(0.64μM)、121.5 Ru(1.25μM)、132.6Ru(2.5μM)、144.1Ru(5μM),随着进样浓度升高,H-89与hPKA-Cα结合表现出良好浓度梯度效应,动力学常数KD为3.21×10-8;阴性对照毒死蜱与hPKA-Cα蛋白结合多浓度叠加在一起,无明显浓度梯度效应。结果表明,戊唑醇可能会以类似H-89方式与hPKA-Cα结合。