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L-蛋氨酸作为多种生物活性物质的合成前体,参与机体多种代谢,目前在制药、食品和化妆品行业具有广泛的应用。发酵法生产氨基酸具有原料利用率高、操作简便、环境污染小等优点,正在逐步取代传统化学合成法。L-蛋氨酸生物合成途径上支路较多,合成蛋氨酸所需能量也较高,且其生物合成受严格调控。目前生物发酵法制备L-蛋氨酸得率普遍较低,不足以支持工业化生产,使科研人员不断进行菌种选育,从多方向提升L-蛋氨酸的微生物产能。扩大目的产物合成优势的研究思路通常分为以下两种:一是减少非必要碳流消耗,二是对目的代谢流进行强化,改良代谢途径关键酶的催化性质,尤其对于需要多酶联合调控的目标产物合成途径,对酶的改造具有重要的研究意义。本研究以谷氨酸棒杆菌为宿主菌,构建基因缺失的谷氨酸棒杆菌CgΔddh和CgΔthr B。对谷氨酸棒杆菌来源的蛋氨酸代谢途径关键酶高丝氨酸O-乙酰基转移酶（Homoserine acyltransferase,HAT）进行体外突变改造,获得酶活提高的突变体,并测定HAT野生型和突变体酶学性质。使用北京棒杆菌来源的天冬氨酸激酶突变体和本研究构建的谷氨酸棒杆菌来源的高丝氨酸乙酰转移酶HAT突变体构建共表达载体。将共表达载体电转入CgΔddh和CgΔthr B,获得两株重组菌,分别是CgΔddh-lys Cm-met XY220R和CgΔthr B-lys Cm-met XY220R,并进行发酵测试。结果如下:1.谷氨酸棒杆菌ddh、thr B缺陷株的构建。基于pk18mobsac B蔗糖致死质粒,在质粒上连接ddh和thr B上下游同源臂,构建谷氨酸棒杆菌ddh、thr B基因敲除载体p K18mobsac B-del ddh、p K18mobsac B-del thr B,基于同源重组对谷氨酸棒杆菌ddh和thr B基因敲除,获得缺陷株,并对缺陷株和野生型进行发酵测试,观测其生长状况良好。2.HAT底物结合位点单突变株构建。通过同源序列比对和HAT-Ac Co A-hom的酶-底物结合模型分析,选取底物乙酰辅酶A周围的关键残基进行突变研究。构建了HAT表达质粒,选取影响底物结合的位点Y220,对该点进行随机饱和突变,高通量筛选得3个酶活提高的突变体,分别为Y220R、Y220T和Y220S。将HAT和Y220R、Y220T和Y220S突变体表达质粒分别导入大肠杆菌进行表达和纯化。SDS-PAGE和Western blot验证表明,HAT野生型和突变型均高效表达。3.对野生型HAT和突变体进行酶动力学测定及酶学性质表征。与野生型相比,突变体Y220R、Y220T和Y220S的Vmax分别提高了2.17倍、1.74倍和1.86倍。野生型的Km值为0.435,Y220R、Y220T和Y220S的Km值分别为0.336、0.639、0.557。野生型的Kcat值为2.339,Y220R、Y220T和Y220S的Kcat值分别为3.738、2.917、3.208,所筛突变体Y220R对底物的亲和力菌较野生型有所提高。3株突变株酶学性质研究结果表明,野生型最适p H为8.0,Y220R、Y220T和Y220S的最适p H分别为7.5、8.0、8.5;最适温度Y220S与野生型一致,Y220R和Y220T最适温度提高;野生型HAT半衰期为4 h,Y220R、Y220T和Y220S的半衰期均延长。抑制剂Met对Y220R、Y220T和Y220S酶活抑制作用减弱。4.蛋氨酸支路关键酶过表达及工程菌构建。通过PCR获取北京棒杆菌来源lys Cm和谷氨酸棒杆菌来源met XY220R基因,构建双基因过表达重组载体PEC-lys Cm-met XY220R。构建2株重组菌,分别是CgΔddh-lys Cm-met XY220R和CgΔthr B-lys Cm-met XY220R,进行发酵测试。从发酵产物上看,2株菌的蛋氨酸产量分别为3.78 g/L和4.32 g/L,是原菌的2.96倍和2.57倍。发现在缺陷株中过表达AK和HAT后,赖氨酸及苏氨酸支路受到遏制,蛋氨酸途径的碳流明显得到提升。