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牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一种可以感染牛、羊、鹿、猪等多种动物的传染病，是长期危害动物养殖业健康发展的严重疾病之一，被国际兽疫局（Office International des Epi-zooties，OIE）定为B类传染病。鉴于当前BVD的流行态势和防治现状，安全有效的BVDV疫苗亟待研发。E0、E2蛋白是BVDV的两个主要保护性抗原，均可用于基因工程疫苗的研究。近年来，国内外学者利用不同的基因、表达系统和疫苗形式，在BVDV新型疫苗的研发上做了很多有益的工作。本研究选择E0、E2基因构建重组卡介苗，开展BVD疫苗的免疫原性研究。本试验首先对C24V标准株的E0基因进行截短和密码子优化，用中心模板法人工合成优化后的E0截短基因，运用重叠延伸剪接术将其与changchun184特异株的E2截短基因进行融合后分别亚克隆至表达载体pMV261和pMV361中构建重组表达质粒；然后将构建的重组表达质粒分别电转化入卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）中，经抗酸染色和菌液PCR鉴定后，在45℃条件下热诱导各重组卡介苗（recombinant BCG，rBCG）总蛋白的表达，并进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测；最后将构建的各rBCG和本实验室已构建的rBCG-pMV361-E2免疫小鼠，运用间接ELISA法检测其血清中的特异性抗体水平，用CCK-8法分析其脾脏中淋巴细胞增殖情况，用生物素双抗体夹心ELISA法分别测定其血清中IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12水平，用流式细胞术检测其脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群含量等指标，对各rBCG的免疫效力进行综合评价。结果成功扩增出了mE0基因和E0-E2融合基因，构建了pMV261-mE0、pMV261-E2、pMV261-E0-E2、pMV361-mE0和pMV361-E0-E2重组表达质粒；在卡介苗中成功表达了大小为18kDa、43.9kDa和66.5kDa的目的蛋白，且具有反应原性；各rBCG免疫小鼠后均能在不同程度上刺激小鼠产生抗BVDV的抗体，经抗原刺激后小鼠淋巴细胞数量均有所增加，免疫期间IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的含量变化表明各rBCG均能够刺激Th1和Th2型反应，且较倾向于Th2型反应，三免后CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的含量均有所变化，表明构建的rBCG均可以在一定程度上诱导小鼠机体产生体液和细胞免疫应答反应，且较侧重于体液免疫应答反应。总体而言，rBCG-pMV261-E0-E2的免疫效果较强于其余各组。本研究证实了E0-E2融合蛋白能提高单一抗原的免疫特性，可作为研发BVDV新型疫苗的候选。成功构建rBCG-pMV261-E0-E2菌株，为研制可同时预防牛病毒性腹泻-黏膜病和结核病的二价基因工程疫苗奠定基础。