多发性骨髓瘤（MM）是全球第二大血液癌症,每年全世界大约新增86000例病例,严重危害人类健康。MM的常规治疗手段包括放疗和造血干细胞移植等,但都存在易复发、预后差等问题。因此,急需探索新的治疗方案,帮助减缓病人的痛苦。CD38是分子量为45KD的单次跨膜糖蛋白,又名ADP核糖环化酶或环ADP核糖水解酶。CD38在正常淋巴细胞和骨髓细胞以及一些非造血器官上低水平表达,但在骨髓瘤细胞表面恒定且高水平表达,所以CD38一直以来被认为是骨髓瘤治疗的潜在靶点。目前,临床上已研发出多款靶向CD38的单克隆抗体,包括处于临床前和临床I/II期的多款抗体,以及FDA批准上市的Daratumumab和Isatuximab两款抗体。这些抗体可通过多重效应机制发挥抗肿瘤活性。在此基础上,靶向CD38的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和抗体偶联药物（ADC）等疗法也有了一定的研究。如Sorrento公司的CD38 CACR-T项目处于临床I期阶段;俄亥俄州立大学的CD38 ADC项目处于临床前阶段。但上述CD38抗体的种类都属于全人抗体或人源化抗体,存在分子量大、组织渗透性差等问题,影响治疗效果。骆驼抗体是天然缺失轻链的同型二聚体,由VHH、CH2、CH3组成。其中,VHH结构域称作纳米抗体,分子量仅为15KD左右,是天然存在的最小的免疫球蛋白功能片段。与常规轻重链抗体相比,纳米抗体具有分子量小、亲和力高、组织渗透性强、可溶性高、免疫原性低等特点。2018年,EMA批准纳米抗体药物Cablivi用于治疗成人获得性血栓性血小板紫癜（a TTP）,Cablivi成为全球首个上市的纳米抗体药物。基于纳米抗体的治疗方案,在癌症的治疗中具有广阔的研究前景。本研究中,我们首先通过噬菌体展示技术筛选得到靶向CD38的候选纳米抗体。在蛋白水平和细胞水平分别通过ELISA和FCM分析验证后,最终得到5条特异性结合CD38的纳米抗体。通过FCM评价抗体的亲和力发现,FA-2E抗体优于阳性对照抗体,FA-7G抗体则与阳性对照抗体相当。在计算机模拟的相互作用评价中,发现5条纳米抗体与CD38抗原的结合区域不同,这也是造成其亲和力不同的原因之一。接着,本研究将5条纳米抗体构建成CAR重组质粒,与慢病毒包装质粒共转染293T细胞后,获得滴度均大于1×10~7TU/m L的病毒液。进一步通过慢病毒感染的方法成功构建3种nano CAR-T细胞和阳性对照CAR-T细胞。在体外抗肿瘤活性评价中,将不同的CAR-T细胞分别与靶细胞MM1S共孵育。我们发现FA-7G-CAR-T细胞杀伤效果最佳,且在4:1的效靶比下,杀伤效果略优于阳性对照组。上述结果为评价nano CAR-T细胞的体内抗肿瘤功能提供了数据支持。进一步,综合上述实验结果,本研究挑选FA-2E和FA-7G两条抗体拟用于ADC的构建。首先通过免疫荧光和流式细胞术评价抗体内吞情况,发现FA-2E的效果更佳,最终选定FA-2E抗体用于构建ADC。本研究通过一步偶联法制备FA-2E-DM1,通过MALDI-TOF分析其抗体偶联比。发现偶联效率仅为35%左右,说明偶联工艺后续仍需优化。在体外抗肿瘤活性评价中,我们发现FA-2E-DM1可以杀伤MM1S靶细胞,但不杀伤CD38阴性的K562细胞。说明FA-2E-DM1可以选择性靶向CD38阳性细胞,具有一定安全性。综上所述,本研究首先筛选获得了特异性靶向CD38的纳米抗体。在此基础上成功构建了FA-7G-CAR-T细胞和FA-2E-DM1抗体偶联药物,并分别评价了体外抗肿瘤活性。本研究为多发性骨髓瘤的治疗研究提供了基础数据支持,并丰富了纳米抗体领域的研究和应用。