研究背景及目的:微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）,是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象,常由错配修复（mismatch repair,MMR）系统功能缺陷引起。微卫星状态不同的实体瘤对免疫检查点抑制剂药物响应率方面有显著差异,提示微卫星状态对肿瘤免疫微环境具有重要影响。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）是由肿瘤细胞、常驻和招募的宿主细胞（与癌症相关的成纤维细胞和免疫细胞）、以及上述细胞的分泌产物（如细胞因子和趋化因子）和细胞外基质中的非细胞成分组成。肿瘤微环境中的淋巴细胞又称为肿瘤浸润淋巴细胞（简称TILs）,包括T细胞、B细胞和自然杀伤性细胞（NK细胞）,在肿瘤免疫中发挥重要作用。研究发现,处于肿瘤微环境中的TILs的抗肿瘤活性远远低于远离肿瘤周围的淋巴细胞。造成这种差异的原因是肿瘤免疫抑制性微环境,它不仅会让周围的细胞产生免疫抑制,同时还会帮助肿瘤细胞逃避免疫攻击。肿瘤免疫抑制性微环境主要是由肿瘤细胞产生的免疫抑制分子、基质成分和免疫抑制性细胞及相关免疫抑制性细胞因子构成。其中主要的免疫抑制性细胞分别为:肿瘤相关巨噬细胞、骨髓来源的抑制性细胞、调节性T细胞、肿瘤相关成纤维细胞。而免疫细胞因子主要包括TGF-β、IL-10、PD1/PDL1等免疫检查点分子及外泌体等。深入探讨肿瘤免疫微环境,为破解肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用提供了重要的线索。胃癌仍然是健康的主要威胁,是世界范围内的第五大常见恶性肿瘤,位于癌症死因第三位。目前采取手术治疗为主,并辅以放疗、化疗、靶向和免疫治疗,但仍有部分患者临床预后较差。基于基因改变的精准治疗已在多种癌症治疗中获得成功,越来越引起人们的广泛关注。作为4种分子亚型之一,MSI胃癌具有一系列独特的分子改变,从而使其在发病机制、临床特征、治疗反应和预后方面具有独特的特征。目前,MSI胃癌免疫相关基因的系统分析尚未见报道,对肿瘤微环境中肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用尚未阐明。本研究旨在探讨不同微卫星状态胃癌微环境中免疫细胞和基因的相关性及可能的调控机制,为解释不同微卫星状态胃癌的发病机制、寻找新的分子标志物和研究新的药物靶点提供实验依据及理论参考。研究方法:第一部分不同微卫星状态胃癌组织中浸润的免疫细胞及其相关基因整合分析1、数据集的下载与整合:我们从TCGA公开的数据库下载胃癌的分子分型数据集,mRNA表达谱数据集和免疫细胞数据集。将以上3个数据集进行整合,剔除没有完整信息的患者。将胃癌样本的ID作为唯一识别码重新编码。本研究最终纳入267例胃癌,其中包含209例MSS胃癌和58例MSI胃癌。2、不同微卫星状态胃癌中浸润的差异免疫细胞（DICs）分析:胃癌整合数据集中包含34种免疫细胞的相对数值,利用SPSS软件比较免疫细胞在MSI和MSS两组间的差异。3、筛选差异表达基因（DEGs）:使用R package TCGA biolinks中edge R方法对MSI和MSS胃癌患者组织中基因mRNA表达进行分析,筛选出DEGs（FDR<0.01和log FC绝对值大于或者等于2）。4、功能（GO）和途径富集（KEGG）分析:通过KEGG pathway、GO Biological Processes、Reactome gene Sets、Canonical Pathways和CORUM进行网络分析并使用Cytoscape可视化。5、蛋白质相互作用（PPI）网络分析:检索相互作用基因（STRING）数据库工具用于评估DEGs之间的交互关系。交互作用综合得分>0.4被认为是显著的。6、统计学分析:所有统计采用R软件和SPSS软件进行,正态分布变量采用student t检验,非正态分布变量采用Mann Whitney U检验,利用SPSS软件的χ2检验或Fisher确切概率法分析免疫细胞与临床病理学特征之间的相关性,利用Kaplan-Meier进行生存分析,P<0.05为差异有统计学意义。第二部分不同微卫星状态胃癌间质浸润免疫细胞与差异表达基因的相关性及其与临床病理学特征和预后的关系1、研究对象:回顾性收集2012年1月至2018年12月在中国医科大学和锦州医科大学附属第一医院进行原发性胃癌手术切除的215例患者。临床病理资料包括年龄、性别、病理组织学类型、浸润深度、淋巴结转移、脉管癌栓及TNM分期等,均来源于病历、病理报告或出院小结。该研究得到了中国和锦州医科大学临床研究伦理委员会的批准。本研究的所有参与者均获得了书面知情同意。2、免疫组化染色:采用SP法进行免疫组化染色。3、免疫组化染色结果判定标准:（1）微卫星状态评估:每一张病理切片先在低倍镜下选取抗体（MLH1、PMS2、MSH2和MSH6）阳性染色区,然后置于高倍镜下进行观察。MLH1、PMS2、MSH2和MSH6均定位于胃癌细胞核,呈黄色或棕黄色颗粒为表达阳性,肿瘤细胞核不着色为缺失,4种蛋白均表达阳性判为MSS,一种或多种蛋白表达缺失判为MSI;（2）PD1和PDL1表达评估:PD1定位于胃癌间质免疫细胞（标记为PD1）的细胞膜和/或细胞质,PDL1定位于胃癌细胞（标记为PDL1[T]）以及胃癌间质免疫细胞（标记为PDL1）的细胞膜和/或细胞质。每个样本随机选择10个高倍视野（HPF,400x）,每个视野下计数100个肿瘤细胞或免疫细胞,计算阳性染色细胞比例,取其平均数作为该指标在该样本中的阳性表达率。PD1和PDL1阳性染色细胞至少为全部肿瘤细胞或间质浸润免疫细胞的1%定义为染色阳性;（3）CD8和CD68表达评估:每个样本随机选10个HPF（肿瘤中心及侵袭前沿各5个）,计数每个HPF下阳性染色细胞数,取其平均数代表整个样本的阳性染色细胞数,计算CD8和CD68平均数的中位数,其中CD8的中位数为72.3,CD68的中位数为43.2。以此中位数为界值分为高密度组和低密度组再进行统计学分析。4、统计学分析:所有统计分析均采用SPSS 23.0进行。MSI、CD8/CD68和PD1/PDL1与临床病理学特征之间的相关性分析使用χ2检验或Fisher确切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验。采用Cox比例危险模型进行单因素和多因素分析。P<0.05为有统计学意义。第三部分PMS2缺失与胃癌临床病理学特征的相关性及其过表达对胃癌细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制1、PMS2缺失与胃癌临床病理学特征的相关性:研究病例信息采集详见第二部分1。2、PMS2过表达对胃癌细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制。（1）筛选PMS2低表达胃癌细胞系,构建与PMS2免疫组化抗体蛋白同一转录本基因序列的过表达质粒（含阴性对照）,利用质粒转染技术构建PMS2过表达的胃癌细胞模型。（2）利用CCK-8实验结果绘制生长曲线,利用real-time PCR技术检测反映增殖指标的表达情况,评估PMS2过表达对胃癌细胞增殖能力的影响。（3）利用real-time PCR技术检测反映凋亡指标的表达情况,以此观察PMS2过表达对胃癌细胞凋亡的影响。（4）利用划痕实验评价PMS2过表达对胃癌细胞迁移能力的影响。（5）利用Transwell方法和real-time PCR技术检测反映侵袭指标的表达情况,评价PMS2过表达对胃癌细胞侵袭能力的影响。（6）利用real-time PCR技术检测反映胃粘膜分化指标的表达情况,评估PMS2过表达对胃癌细胞分化能力的影响。3、统计学分析:所有统计分析使用SPSS软件完成。通过stuent t检验和Mann-Whitney U检验评估组间差异的显着性,PMS2与临床病理因素之间的相关性分析使用χ2检验或Fisher确切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier分析。P<0.05为有统计学意义。结果:第一部分不同微卫星状态胃癌组织中浸润的免疫细胞及其相关基因整合分析1、不同微卫星状态胃癌中浸润的差异免疫细胞及其与临床病理学特征的相关性分析:（1）不同微卫星状态胃癌中浸润的差异免疫细胞（DICs）分析:34种免疫细胞中有12种具有显著性差异;与MSS胃癌相比,MSI胃癌中7种免疫细胞显著上调,包括T Cells CD8、Macrophages M1、IFN gamma Response、Th2 Cells、Mast Cells Activated、NK Cells Activated和T Cells CD4 Memory Activated;5种免疫细胞显著下调,包括TGF beta Response、B Cells Na（?）ve、Mast Cells Resting、Monocytes和Plasma Cells。（2）12种差异免疫细胞与临床病理学特征的相关性分析:在MSI胃癌组,Macrophages M1在高分化胃癌多见;IFN-gamma Response和Mast Cells Resting在无淋巴结转移胃癌常见;Mast Cells Activated在有淋巴结转移胃癌常见;T Cells CD4Memory Activated在≤60岁胃癌常见。而在MSS胃癌组,Macrophages M1在T3+T4胃癌常见;T Cells CD8、TGF-beta Response和Mast Cells Resting均在弥漫型、低分化和T3+T4胃癌常见;Th2 Cells、Mast Cells Activated和T Cells CD4 Memory Activated在肠型和高分化胃癌常见;IFN-gamma Response在T3+T4胃癌常见;Plasma Cells在肠型胃癌常见。2、不同微卫星状态胃癌差异表达基因的筛选及其GO和KEGG富集分析:（1）筛选差异表达基因（DEGs）:不同微卫星状态胃癌中共有75个DEGs,包括CD274,PDCD1,MYC,AQP2,ASCL1等。在MSI胃癌中,除了CD274,PDCD1,PDCD2,MYC,QRSL1,RNASE2,SEMG1和TRIM69 mRNA表达显著上调外,其它基因的mRNA表达均显著下调。（2）DEGs的GO和KEGG分析:上述75个DEGs主要集中在以下集群:胰液分泌、体液免疫反应、内分泌相关（NEUROG3+）祖细胞基因表达的调控、激素水平调节和蛋白质消化吸收、NABA微粒体相关、区域化、基质金属蛋白酶激活和B/2类（分泌素家族受体）等。3、不同微卫星状态胃癌浸润的差异免疫细胞与差异表达基因的相关性分析:（1）不同微卫星状态胃癌浸润的DICs与DEGs的相关性分析:不同微卫星状态胃癌的75个DEGs中除了FGF3,FGF19,WIFI和RBPJL外,其他71个基因与12种DICs均具有显著相关性。（2）DICs相关的DEGs的GO和KEGG分析:以上71个DEGs主要集中在激素水平的调节、体液免疫反应、区域化、细胞金属离子稳态和细胞分泌的调节等方面;12种DICs相关的DEGs及其富集的集群之间具有显著的交叉重叠。（3）71个DEGs的PPI网络分析:通过STRING进行网络分析发现,以上71个DEGs的蛋白之间存在相互作用。4.不同微卫星状态对胃癌预后的影响:生存分析显示,微卫星状态对胃癌预后未见显著影响。第二部分不同微卫星状态胃癌间质浸润免疫细胞与差异表达基因的相关性及其与临床病理学特征和预后的关系1、胃癌组织中微卫星状态的判定及其与临床病理学特征的相关性:根据MLH1、PMS2、MSH2和MSH的免疫组化结果,本研究在215例胃癌中检测到46例MSI胃癌,占21.4%。其中,MLH1和PMS2同时缺失为10例,占MSI的21.7%;PMS2总缺失共32例,占MSI的69.6%;MLH1总缺失共16例,占MSI的34.8%;MSH2缺失共1例,占MSI的2.1%;MSH6缺失共7例,占MSI的15.2%。2、不同微卫星状态胃癌组织中CD8+T/CD68+M细胞密度的差异:MSI胃癌组织中CD8+T/CD68+M细胞密度均高于MSS胃癌。3、不同微卫星状态胃癌组织中PD1/PDL1蛋白表达的差异:MSI胃癌组织中PD1/PDL1蛋白表达均高于MSS胃癌。4、不同微卫星状态胃癌组织中CD8+T/CD68+M细胞密度与PD1/PDL1蛋白表达的相关性:MSI胃癌中CD8+T细胞密度与PD1蛋白表达相关;MSS胃癌中CD68+M细胞密度与PDL1蛋白表达显著相关。5、不同微卫星状态胃癌组织中不同部位CD8+T/CD68+M细胞密度与PD1/PDL1蛋白表达的相关性分析:在MSI胃癌侵袭前沿,CD8+T细胞高密度与PD1蛋白表达显著相关。在MSS胃癌肿瘤中心及侵袭前沿,CD68+M细胞高密度与PDL1蛋白表达显著相关。6、胃癌组织中CD8+T/CD68+M细胞密度和PD1/PDL1蛋白表达与临床病理学特征的相关性:CD68+M高密度在老年（>60岁）患者多见,而且随着TNM分期的增加而增加;PDL1[T]和PDL1阳性在T3+T4浸润、有淋巴结转移和有脉管癌栓患者中均多见;而CD8+T细胞密度和PD1蛋白表达与临床病理学特征无显著的相关性。7、胃癌组织中CD8+T/CD68+M细胞密度与PD1/PDL1蛋白表达与预后的关系:MSI、PD1阳性、PDL1[T]阴性和PDL1阴性胃癌患者预后较好。Cox多因素分析显示,MSI、CD8+T细胞密度、PDL1[T]、TNM分期、浸润深度和脉管癌栓均是胃癌的独立预后因素。第三部分PMS2缺失与胃癌临床病理学特征的相关性及其过表达对胃癌细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制1、PMS2缺失与胃癌临床病理学特征的相关性:（1）PMS2缺失与女性、老年（>60岁）、TNM分期（Ⅰ+Ⅱ期）、无淋巴结转移和无脉管癌栓显著相关。（2）生存分析显示PMS2缺失胃癌患者预后优于阳性表达患者（p=0.069）。2、PMS2过表达对胃癌细胞生物学行为及其可能的调控机制（1）筛选PMS2低表达胃癌细胞系:利用real-time PCR和Western Blot检测七种胃癌细胞系中PMS2 mRNA和蛋白的表达,结果发现AGS和HGC27细胞中表达较低,选为实验用胃癌细胞系。（2）瞬时转染建立PMS2过表达胃癌细胞模型:构建与PMS2免疫组化抗体蛋白同一转录本基因序列的过表达质粒（含阴性对照）,然后转染至AGS和HGC27细胞（AGSOE和HGC27OE）,对照组转染阴性对照质粒（AGSNC和HGC27NC）。通过real-time PCR及Western blot实验检测证实PMS2过表达胃癌细胞模型构建成功。（3）PMS2过表达对胃癌细胞增殖的影响:CCK-8实验发现PMS2过表达后AGS和HGC27细胞增殖能力降低。Real-time PCR检测增殖标志物Ki-67及PCNA mRNA表达。统计分析发现,PMS2过表达后AGS和HGC27细胞Ki-67 mRNA表达均显著降低（p=0.034和0.015）;PMS2过表达后HGC27细胞PCNA mRNA表达水平显著降低（p=0.002）,而AGS细胞没有统计学意义（p=0.634）。（4）PMS2过表达对胃癌细胞凋亡的影响:Real-time PCR检测AGS和HGC27细胞PMS2过表达前后凋亡标志物Cytochrome C及TFAR mRNA表达。统计分析发现,PMS2过表达后AGS和HGC27细胞Cytochrome C及TFAR mRNA表达均显著升高（p值分别为0.001,0.008,0.049和0.003）。（5）PMS2过表达对胃癌细胞迁移的影响:划痕实验表明PMS2过表达对AGS和HGC27细胞的迁移能力无显著影响。（6）PMS2过表达对胃癌细胞侵袭的影响:Transwell实验表明PMS2过表达对AGS和HGC27细胞侵袭能力无影响;Real-time PCR检测细胞迁移能力的标志物nm23及MMP9 mRNA表达无明显变化。（7）PMS2过表达对胃癌细胞分化的影响:Real-time PCR检测AGS和HGC27细胞分化成熟标志物Vimetin、SOX2、E-cadherin和CDX2 mRNA表达。统计分析发现,PMS2过表达后AGS和HGC27细胞SOX2 mRNA表达均显著下降（p值分别为0.012和0.002）。结论:1、不同微卫星状态胃癌微环境中的免疫细胞和基因均具有显著差异。DICs不仅与临床病理学特征相关,而且与DEGs显著相关。DICs相关的DEGs集中在不同的生物学过程和通路,而且DICs相关的DEGs之间及其富集的集群之间存在交叉重叠。不同微卫星状态胃癌的DEGs可能通过影响微环境中免疫细胞的类型和功能从而改变胃癌细胞的临床生物学行为,最终导致了不同的临床结局。2、MSI胃癌组织中CD8+T/CD68+M细胞密度和PD1/PDL1蛋白表达均高于与MSS胃癌。不同微卫星状态胃癌微环境中CD8+T/CD68+M细胞密度与PD1/PDL1蛋白表达相关,尤其在侵袭前沿,它们可能参与了胃癌的免疫逃逸并影响了免疫治疗的疗效。MSI、PD1阳性、PDL1[T]和PDL1阴性胃癌患者预后较好,Cox多因素分析显示,CD8+T细胞密度、PDL1[T]均是胃癌预后的独立预后因素,可作为预后标志物。3、PMS2缺失与女性、老年（>60岁）、TNM分期（Ⅰ+Ⅱ期）、无淋巴结转移和无脉管癌栓等临床病理学特征显著相关。生存分析显示PMS2缺失胃癌患者预后较好。PMS2过表达后胃癌细胞增殖能力下降;凋亡能力显著升高;迁移和侵袭无明显变化;分化标志物SOX2 mRNA表达显著下降,提示PMS2可能主要通过影响胃癌细胞的增殖或凋亡来影响胃癌发生发展。