喉癌是头颈部常见的肿瘤之一,每年世界范围内喉癌新发病例为177422例,死亡约94771例。近年来,虽然喉癌的发病率呈现一个逐渐下降的趋势,但喉癌的五年生存率在过去40年明显下降,从66%下降至63%,这在肿瘤疾病当中是比较少见的。另外,据统计约40%的喉癌患者确诊时即是晚期（III期或IV期）,甚至伴发转移,严重影响了喉癌患者预后。喉癌发生可能是由于吸烟,饮酒,乳头瘤病毒感染以及接触有害粉尘所引起的一系列基因改变所致。然而,喉癌的具体发病机制尚不明确,并且在诊断、治疗及预后方面缺少理想的生物标志物。因此,致病基因的筛选及深入探索发病的分子机制,对于优化喉癌诊断及发掘潜在治疗靶点具有重要意义。使用第二代高通量测序进行喉癌转录组学分析,有助于发掘与喉癌相关的致病基因,进而阐释喉癌发生及发展机制。人类基因组测序分析显示,全部基因组序列的绝大多数为不具有编码蛋白质功能的DNA,而全基因组的2%为能够进行编码的DNA,这些不具有编码功能的DNA的转录产物被称为非编码RNA。环状RNA是一种由信使RNA前体（pre-mRNA）经3’-5’端反向剪接形成的单链闭环的非编码RNA,大量、稳定存在于细胞内及细胞外,赋予环状RNA高度保守,表达丰度高以及组织特异性的特点。近年研究报道环状circRNA参与人类神经精神疾病、心血管疾病等疾病特别是肿瘤的发生发展。以上证据提示circRNA有望成为某些疾病,甚至是喉癌理想的生物标志物。因此,通过全转录组分析,筛选差异表达的circRNA,并进行验证和机制研究,将会有助于喉癌的诊断、治疗和预后。本研究分为以下三部分。第一部分喉癌全转录组测序分析目的:本研究利用第二代高通量测序技术分析了5例喉癌组织患者的癌组织和癌旁组织中差异表达的circRNA表达谱,鉴定新的转录本,筛选致病相关基因,为喉癌的诊断、治疗及预后判断提供特异性标志物。方法:收集切除的喉癌及癌旁组织标本,Trizol法提取RNA,Agilent2100检测RNA完整性,使用生物素标记的特异性探针纯化RNA,构建测序文库并进行质检,使用Illumina Hi Seq X Ten测序,对circRNA进行定量,构建基因表达谱,使用DEGseq和DEseq2方法筛选差异基因,并对circRNA所来源的基因进行NR、GO、KEGG等数据库的注释,进行GO功能分析、KEGG通路富集及Pathway功能富集分析,使用Pearson相关性绘制共表达网络,构建ceRNA调控网络,应用生物信息学软件Target Scan、miRwail和Circ Iteractome分析测序结果。最后,筛选2个环状RNA,2个lncRNA以及1个mRNA,用实时定量PCR对筛选的5个基因以及对应的共表达基因进行表达量验证。结果:纳入本研究的组织样本RNA完整性良好,质控合格,测序总共检测到153676个转录本表达,其中circRNA 22580个,lncRNA 86424个,mRNA44672个。对差异表达的基因进行GO功能富集,结果显示差异表达基因富集的功能集中于细胞周期,细胞粘附,细胞器合成,催化活性,分子功能调节,核酸结合转录因子活性。KEGG通路分析显示差异基因富集的通路主要是细胞凋亡,丝裂原活化蛋白激酶通路,泛素介导的蛋白降解途径,腺苷酸活化蛋白激酶通路,m TOR信号通路,FOXO信号通路。依据相关性大于0.99或小于-0.99,筛选出相关RNA,绘制circRNA-miRNA-mRNA互作网络,选择差异表达排序前20的ncRNA绘制ceRNA网络。实时荧光定量PCR结果显示对于所筛选的基因表达趋势与测序结果基本一致。与SNHG29共表达的mRNA表达趋势与SNHG29一致或者相反。结论:通过转录组测序,我们发现了全新的转录本,可作为喉癌的诊断及判断预后的有效生物标志物;差异基因的功能富集分析、共表达分析以及ceRNA网络有助于喉癌发病机制的研究,为精准治疗提供科学依据。第二部分Circ-RANBP9在喉癌的表达检测及临床意义研究目的:鉴于环状RNA的高度保守、稳定与组织特异性,差异表达的circRNA有助于喉癌的诊断、治疗和预后判断,并且在喉癌的发生、发展过程中发挥重要作用。我们从中筛选了1个差异表达的circRNA,通过RT-qPCR检测上述circRNA在喉癌组织中的差异表达水平,并分析其临床意义。方法:收集47例患者的喉癌及癌旁组织,Trizol法提取RNA,RNA浓度与纯度确认RNA完整性,进行RT-qPCR,验证circ-RANBP9的表达水平。同时使用单因素方差分析对circ-RANBP9进行临床相关性分析。进而通过CCK-8实验,EdU实验,划痕实验,transwell实验来验证circ-RANBP9对喉癌增殖,侵袭与迁移能力的影响。使用Pearson相关性绘制共表达网络,构建ceRNA调控网络,进而对共表达分析及ceRNA调控网络进行GO及KEGG富集分析,判断circ-RANBP9在喉癌中可能发挥的作用。结果:Circ-RANBP9在喉癌中明显低表达（P<0.001）,并且其低表达与T分期（P=0.018）,临床分期（P=0.003）,肿瘤分化（P=0.031）及淋巴结转移（P=0.046）密切相关,有望成为喉癌早期诊断的生物学标记物（AUC:0.716,敏感性:97.9%,特异性:55.3%）。通过生物信息学分析发现,circ-RANBP9可能通过miR-4746-3p,miR-4757-5p,miR-3131,and miR-611而作用于JAK3,FOXN1,MYC,and APC2,进而调控细胞外基质（ECM）-受体相互作用,c AMP,钙和Wnt信号通路。结论:筛选的circ-RANBP9在喉癌组织中表达趋势与测序结果一致;circ-RANBP9在喉癌组织中低表达,具有良好的诊断敏感性与特异性,有助于喉癌的早期诊断与判断预后;circ-RANBP9可能通过外基质（ECM）-受体相互作用,c AMP,钙和Wnt信号通路发挥作用。第三部分Circ-MTCL1在喉癌中作用机制的研究目的:因为circ-MTCL1在喉癌组织中高表达,我们推测其在喉癌发生、发展过程中起到促癌作用。因此,我们通过成环特点分析,功能实验,裸鼠成瘤实验进一步研究该环状RNA在喉癌中的具体作用机制。方法:应用Sanger测序,核酸外切酶消化试验分析circ-MTCL1成环特征;运用荧光原位杂交、核质分离实验对circ-MTCL1进行亚细胞定位;选择TU212和LCC细胞系,干扰circ-MTCL1的表达,进行EdU实验明确circ-MTCL1对喉癌细胞增殖水平的影响;通过Transwell实验验证circ-MTCL1对喉癌细胞侵袭水平的影响;使用划痕实验检测circ-MTCL1对喉癌细胞的迁移能力的影响;Pulldown实验验证circ-MTCL1是否参与ceRNA机制,检测与circ-MTCL1直接结合的蛋白质。RIP实验验证circ-MTCL1与蛋白质的结合。Co-IP实验验证蛋白质与下游蛋白的结合作用。裸鼠成瘤实验明确circ-MTCL1对肿瘤生长的影响。结果:Circ-MTCL1由MTCL1基因剪切环化而成,位于chr18:8718421-8720494,长度为384nt,剪切点为GC,定位于喉癌细胞胞浆中,可耐受核酸外切酶消化。沉默circ-MTCL1后,喉癌的细胞活力、侵袭能力,迁移能力受抑制。过表达circ-MTCL1后,喉癌的细胞活力、侵袭能力、迁移能力增强。Circ-MTCL1与C1QBP在组织及细胞系中表达呈正相关,circ-MTCL1能够通过抑制C1QBP降解增加C1QBP的表达量,并通过与C1QBP结合从而激活wnt/β-catenin通路,进而影响喉癌细胞的增殖、侵袭、迁移的能力。Circ-MTCL1影响裸鼠移植瘤的生长以及转移。结论:Circ-MTCL1是喉癌早期诊断以及预后判断中有效的生物标志物;可通过C1QBP影响wnt/β-catenin通路;Circ-MTCL1在喉癌的增殖、侵袭以及迁移过程中发挥重要作用。