目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种由神经元丢失导致的中枢神经系统退行性疾病,其主要特点为持续性认知能力下降以及脑功能衰退,其病因和发病机制至今尚未阐明。铁、铜、锌等金属离子代谢异常是AD发病中的关键因素,参与β淀粉样蛋白（β-Amyloid,Aβ）的分泌和沉积。Aβ是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的小分子水解多肽,在细胞外以寡聚肽和凝聚肽两种方式存在,凝聚肽构成老年斑的核心成分,而不同聚合方式的寡聚肽则更多的表现为神经毒性,可能是造成神经元损伤的关键分子。因而与金属离子代谢相关蛋白的表达和调控被认为是维持机体内离子稳态的重要环节。二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1,DMT1）参与脑内多种二价金属离子的转运,课题组前期工作发现DMT1在AD患者及动物模型中存在异常分布与表达,且能够促进Aβ寡聚体的神经毒性。于2000年被发现的Nedd4 family interacting protein 1（Ndfip1）蛋白,能特异性结合Neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 4（Nedd4）蛋白家族,促进DMT1的泛素化降解,抑制DMT1的转运功能,减少神经元细胞质中铁离子的水平,不仅能够防止神经元铁中毒、促进脑外伤后神经细胞的存活,还能减轻铁协同作用下6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的多巴胺能神经元损伤以及1-甲基-4-苯基砒啶（1-methyl-4-phenylpyridine,MPP+）诱导的神经细胞凋亡。我们前期工作证实Ndfip1蛋白在APP/PS1转基因AD小鼠的皮层与海马内表达减少,免疫荧光双标染色和共聚焦激光扫描显微镜观察显示APP/PS1转基因小鼠脑内的Ndfip1蛋白与Aβ的分布一致。据此,我们认为在AD发生和发展过程中,Ndfip1蛋白在脑内异常分布且表达量降低,无法有效地启动泛素化进程,进一步导致相关功能蛋白堆积和功能异常,从而造成神经元损伤和死亡。为进一步的探索Ndfip1在AD病理过程中的作用机制,探讨靶向Ndfip1治疗AD的可行性,我们构建了脑内特异性过表达Ndfip1的转基因小鼠,通过侧脑室注射Aβ1-42寡聚体(Aβ1-42oligomers,AβOs)诱导的神经毒性损伤模型,应用行为学、形态学和分子生物学技术,验证Ndfip1在AβOs引起的神经元毒性中的保护作用,揭示相关的分子生物学机制,为基于Ndfip1蛋白的AD预防和治疗提供理论依据和技术支持。方法:一、脑内特异性过表达Ndfip1转基因小鼠的鉴定1、利用Piggy BAC转座酶系统,采用受精卵注射方式,将iZEG-NDFIP1随机插入小鼠基因组,获得iZEG-NDFIP1转基因的首建鼠。2、iZEG-NDFIP1转基因阳性小鼠与Camk IIa-Cre转基因小鼠进行繁育,通过PCR方法和Lac Z染色鉴定仔鼠的鼠尾DNA,获得脑内特异性过表达Ndfip1的转基因（Ndfip1 Tg）小鼠。3、应用免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜观察4月龄的Ndfip1 Tg小鼠脑内Ndfip1蛋白的分布与表达状态;应用Western blot和RT-PCR技术检测4月龄的Ndfip1 Tg小鼠皮层和海马中Ndfip1蛋白变化及基因表达水平。4、观察不同月龄Ndfip1 Tg小鼠的体重等生理指标变化。5、筑巢实验评估Ndfip1 Tg小鼠的日常行为。6、测量4月龄Ndfip1 Tg小鼠的肝脏、肾脏、脾脏、脑组织及皮层、海马、黑质、纹状体四个部位的组织重量。应用原子吸收光谱法（AAS）检测4月龄Ndfip1 Tg小鼠皮层、海马、黑质、纹状体、肝脏、脾脏、肾脏以及血液中的铁含量。二、脑内特异性过表达Ndfip1对AβOs损伤神经元的保护作用1、4月龄Ndfip1 Tg小鼠和同窝野生型小鼠分笼饲养,每笼2-3只,两组小鼠各自随机分为对照组与AβOs组,即野生型对照组（WT）、野生型AβOs组（WT/AβOs）、Ndfip1 Tg对照组（Ndfip1 Tg）、Ndfip1 Tg/AβOs组（Ndfip1Tg/AβOs）,每组6-8只小鼠,实验开始前、后观察体重等生物学指标的变化。2、制备AβOs诱导的神经毒性损伤模型,采用侧脑室注射技术分别对野生型小鼠和Ndfip1 Tg小鼠注射AβOs,对照组小鼠注射等体积生理盐水。3、应用Morris水迷宫实验评估四组小鼠空间认知和学习记忆能力。4、行为学评估后,对各组小鼠脑组织进行形态学分析。应用免疫组织化学染色观察Neu N的分布与表达状态;尼氏染色观察皮层、海马区内神经元损伤状态;TUNEL染色检测皮层、海马区内神经元凋亡的情况。5、应用Western blot和RT-PCR技术检测小鼠皮层与海马组织的突触后致密物蛋白95（postsynaptic density protein 95,PSD95）、突触素1（synapse protein1,SYN1）蛋白变化及基因表达水平。三、脑内特异性过表达Ndfip1对AβOs损伤神经元保护作用的机制研究1、应用免疫组织化学染色观察各组小鼠的Cleaved-Caspase3、DMT1蛋白的分布与表达状态。2、应用Western blot技术检测各组小鼠皮层与海马组织的蛋白表达水平:观察Caspase-3、Cleaved-Caspase3、ERK1/2、p-ERK1/2、Ndfip1、DMT1蛋白含量的变化。3、应用原子吸收光谱法（AAS）检测各组小鼠皮层和海马的铁含量。4、使用ROS试剂盒检测各组小鼠皮层和海马组织的活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生。5、使用ELISA试剂盒检测各组小鼠皮层和海马中的3-NT、4-HNE、8-OHd G的浓度。结果:1、脑内特异性过表达Ndfip1转基因小鼠构建成功,通过繁育和基因型鉴定获得稳定的Ndfip1 Tg小鼠。2、Ndfip1蛋白在Ndfip1 Tg小鼠的大脑皮层和海马的神经元胞浆中表达增加。Western blot和RT-PCR结果显示转基因小鼠皮层和海马中Ndfip1蛋白及m RNA基因表达水平明显增加（P<0.01）。3、观察1月龄、4月龄、8月龄、12月龄转基因小鼠的体重情况,通过与年龄匹配的野生型小鼠比较,无差异性。4月龄转基因小鼠的各个脏器重量与体重比值、皮层、海马、黑质、纹状体与大脑重量比值、筑巢行为与野生型小鼠比较,无统计学上的差异性。4、转基因小鼠的皮层、海马、黑质、纹状体、肝脏、肾脏、脾脏及血液中铁含量与野生型小鼠比较,无差异性。5、WT组、WT/AβOs组、Ndfip1 Tg组、Ndfip1 Tg/AβOs组小鼠搜索平台的潜伏期及找到平台所经过的路程随实验天数增加均呈减少趋势。WT/AβOs小鼠与WT小鼠相比平均逃避潜伏期和搜索路程显著增加（P<0.05）,而Ndfip1Tg/AβOs小鼠平均逃避潜伏期和搜索路程明显低于WT/AβOs小鼠（P<0.05）。WT小鼠和Ndfip1 Tg两组小鼠在目标区域中停留的时间和进入目标区域的次数明显大于WT/AβOs组小鼠（P<0.05）。6、WT小鼠和Ndfip1 Tg小鼠脑内Neu N标记免疫组织化学染色未见明显神经元损害性改变,皮层和海马神经元形态正常。WT/AβOs小鼠皮层和海马Neu N阳性染色神经元明显减少（P<0.01）,海马椎体神经元排列松散。Ndfip1 Tg/AβOs小鼠与野生型AβOs小鼠相比,Neu N阳性神经元数量增多（P<0.01）。7、WT小鼠与Ndfip1 Tg小鼠皮层和海马CA1区神经细胞排列密集、整齐,胞浆中尼氏体丰富,尼氏小体呈深紫蓝色,细胞核淡蓝色;WT/AβOs小鼠神经元数量减少,排列稀疏,细胞间隙增大,胞浆内尼氏体减少,分界不清,染成淡紫色（P<0.01）。Ndfip1 Tg/AβOs组小鼠与WT/AβOs小鼠相比,细胞数量和胞浆内尼氏体减少不明显（P<0.01）。8、TUNEL染色中WT组和Ndfip1 Tg组小鼠皮层和海马内几乎没有TUNEL阳性细胞。WT/AβOs小鼠皮层和海马的TUNEL阳性染色的神经元数量与WT小鼠相比明显增多（P<0.01）。而Ndfip1 Tg/AβOs小鼠皮层和海马的凋亡神经元较其对照组有增多（P<0.01）,但明显少于WT/AβOs小鼠（P<0.01）。9、Western blot结果显示WT/AβOs小鼠与WT小鼠相比,皮层和海马的PSD95和SYN1蛋白的表达及活性显著降低（P<0.05）,而Ndfip1 Tg/AβOs小鼠的PSD95和SYN1蛋白表达水平明显高于WT/AβOs小鼠（P<0.05）。RT-PCR结果显示,四组小鼠皮层和海马内的PSD95和SYN1的m RNA水平表达与这两种蛋白表达变化相一致。10、Western blot结果显示,与WT小鼠相比,转基因小鼠中Ndfip1蛋白水平显著提高（P<0.05）。与WT或AβOs处理的Ndfip1 Tg小鼠相比,WT/AβOs小鼠的皮层和海马中Ndfip1蛋白水平显著降低（P<0.05）。Western blot和免疫组织化学结果显示,DMT1的表达和分布在WT/AβOs小鼠的皮层和海马区显著升高（P<0.05）,Ndfip1 Tg/AβOs小鼠与WT/AβOs组相比,DMT1的表达水平显著降低（P<0.05）。11、WT/AβOs组与WT组比较,ROS、3-NT、4HNE、8-OHd G浓度增加（P<0.05）,而同样侧脑室注射AβOs,Ndfip1 Tg小鼠与野生型小鼠相比,ROS、3-NT、4HNE、8-OHd G显著降低（P<0.05）。12、接受AβOs侧脑室注射的WT小鼠和Ndfip1 Tg小鼠皮层和海马的Caspase-3的活化均较生理盐水注射组增多（P<0.05）,但Ndfip1 Tg/AβOs小鼠Caspase-3的活化的上调不显著（P<0.05）。Cleaved-Caspase3蛋白的免疫组织化学结果可见,WT/AβOs组在皮层和海马区阳性细胞明显增多（P<0.01）,而Ndfip1 Tg/AβOs组与WT/AβOs组相比,阳性细胞明显减少（P<0.05）。13、Western blot结果显示,四组小鼠的皮层与海马中ERK1/2的总表达水平没有发生变化;与转基因小鼠相比,野生型小鼠的皮层和海马中的p-ERK1/2与ERK1/2的比值显著增加（P<0.05）。与对照组相比,AβOs处理后的两组分别上调了p-ERK1/2与ERK1/2的比值（P<0.05）。WT/AβOs组的ERK1/2激活状态明显高于Ndfip1 Tg/AβOs组（P<0.05）。结论:1、Ndfip1蛋白可以拮抗Aβ1-42寡聚体诱导的神经元毒性,防止神经元损伤及促进神经细胞存活;2、Ndfip1蛋白可以负性调控DMT1蛋白,进而维持细胞内铁离子的稳态,减少ROS的产生及氧化应激反应,减轻Aβ1-42寡聚体引起的神经元损伤;3、Ndfip1蛋白通过抑制ERK1/2的激活,进而调控Caspase-3蛋白激活,减轻Aβ1-42寡聚体引起的神经元凋亡。