怀山药多糖的结构鉴定及活性评价

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天然多糖以其诸多的生物和药理作用引起广泛关注,经研究发现,多糖活性受其结构的影响。本文以怀山药多糖为研究对象,利用生物大分子研究的最新技术和现代分离、分析手段,对山药纯化多糖DOP1-1、DOP1-2、DOP1-3、DOP2-1和DOP2-3的结构进行测定,着重鉴定了DOP1-1和DOP2-1的结构。同时对怀山药多糖的抗氧化活性、体外模拟胃肠道消化活性、抗炎活性以及抗癌活性进行了研究,尝试揭示怀山药多糖结构与其重要生物活性之间的关系。主要研究内容与结果如下:通过水提、分级醇沉,得到三种不同分子量段的怀山药粗多糖,进一步通过离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析等多级层析纯化方法获得五个山药纯化多糖片段DOP1-1、DOP1-2、DOP1-3、DOP2-1和DOP2-3。经测定,分子量分别1.563×10~4 Da、1.261×10~4Da、2.843×10~4 Da、3.232×10~4Da和1.222×10~5 Da。采用紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱、高效液相色谱并结合甲基化反应等研究方法推测了山药纯化多糖DOP1-1、DOP1-2、DOP1-3、DOP2-1和DOP2-3的结构。DOP1-1的单糖组成摩尔比为甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:岩藻糖=155.71:1:1.83:66.44:12.25:6.32:2.60:10.05,DOP1-1主要由→2)-β-Manp-(1→连接而成,且结构中包括[→2)-β-Manp-(1→4)-α-Glcp-(1→2)-β-Manp-(1→]2n、[→1)-β-Manp-(2→1)-α-Galp A-(4→]11n和[→2)-β-Manp-(1→2)-β-Manp-(1→]5n。DOP1-2的单糖组成摩尔比为甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:岩藻糖=106.65:1.88:1.44:32.97:3.74:2.54:1:6.09,DOP1-2以甘露糖为主链,支链包括→4)-α-Galp A-(1→、→4)-Glc-(1→和岩藻糖。DOP1-3单糖组成的摩尔比为甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:岩藻糖=116.10:1:2.58:36.44:2.57:3.34:1.31:7.69,DOP1-3以甘露糖为主链,支链包括以下四种连接方式:→4)-α-Galp A-(1→、→4)-Glc-(1→、1,3,4-Glc和→4)-Ara-(1→。DOP2-1由甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,摩尔比为甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=64.20:1:5.74:2.15:49.61:100.65:32.42,推测DOP2-1的骨架结构为→1)-β-D-Galp-(4→,支链主要是甘露糖和葡糖糖通过1,4-β糖苷键连接而成,1,2-β-Rha和→1)-α-Arbf-(5→通过1,3,6-β-Man连接到支链上。DOP2-3单糖组成的摩尔比为甘露糖:核糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:岩藻糖=117.20:1:3.04:37.16:2.75:9.32:2.74:8.11。扫描电镜和X-射线衍射结果说明山药纯化多糖是松散的、树枝状的半结晶聚合物。怀山药多糖的体外抗氧化活性研究考察了山药水溶性多糖DOP1、DOP2和DOP3对DPPH自由基和羟自由基的清除效果和还原力的测定。DOP3还原力较高,其次是DOP1,DOP2的还原能力最弱。在10.0 mg/m L时,DOP1、DOP2和DOP3对于DPPH自由基的清除能力分别为88.01%、90.85%和76.72%;对羟自由基的清除率分别为82.21%、58.30%和86.51%。体外模拟胃肠道消化,DOP1在胃液中有较低程度的降解,分子量有所减小,伴有还原糖和游离单糖的产生;在肠道消化时未被降解,分子量基本不变,无还原糖和游离单糖的产生。DOP2在胃消化过程中可能被低程度降解,分子量降低,还原糖含量变化无规律和伴随单糖的生成;对肠道消化有抗性。DOP3不被胃消化;在肠中有较低程度的降解,虽然分子量增大,但有还原糖和游离单糖生成。为了验证多糖在人体消化过程中持续表现其活性,测定其抗氧化活性,结果表明DOP1和DOP2在胃肠道消化后仍具有一定的抗氧化能力。对五种纯化多糖进行体外抗炎及抗癌实验,发现DOP1-1和DOP2-1对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞有抑制增殖作用。通过构建角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型研究山药多糖的抗炎活性,结果表明DOP1和DOP2对炎症渗出物具有抑制作用,所以,DOP1和DOP2可以作为一种新型保健食品来开发。同时,DOP2-1能使SNU-739和Hep G2肝癌细胞生长受抑制,对Hep G2细胞的抑制作用强于SNU-739细胞,且呈现出剂量依赖。本论文采用现代分析和生物大分子研究技术对山药多糖进行表征,初步推测了怀山药多糖的结构,山药多糖的部分活性研究为揭示山药多糖的构效关系奠定了基础。
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