【摘 要】
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目的探讨苦参碱对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转作用及在数据中筛选出的在A549细胞及A549/DDP细胞中的表达明显差异的长链非编码RNA lnc01021在其中的调控作用及机制。方法1.常规培养A549、A549/DDP细胞。2.MTT试验检测A549、A549/DDP细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50),并计算耐药细胞株A549/DDP的耐药指数。3.MTT检测苦参碱逆转A549/DDP细胞耐药的
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目的探讨苦参碱对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转作用及在数据中筛选出的在A549细胞及A549/DDP细胞中的表达明显差异的长链非编码RNA lnc01021在其中的调控作用及机制。方法1.常规培养A549、A549/DDP细胞。2.MTT试验检测A549、A549/DDP细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50),并计算耐药细胞株A549/DDP的耐药指数。3.MTT检测苦参碱逆转A549/DDP细胞耐药的逆转倍数。4.通过GEO数据库筛选在顺铂敏感细胞株A549和顺铂耐药细胞株A549/DDP中表达具有显著差异的长链非编码RNA（lnc RNA）。5.逆转录-实时荧光定量PCR（q RT-PCR）验证并选择出表达差异最显著的lnc RNA为lnc01021。6.合成lnc01021的小干扰RNA片段（三条）,用脂质体将其转染A549/DDP细胞,q RT-PCR筛选最佳干扰片段。7.细胞水平测定lnc01021对A549/DDP细胞增殖和凋亡的影响:敲低lnc01021后,用MTT测定其对A549/DDP细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测其对凋亡的影响。8.分子水平研究lnc01021发挥逆转耐药作用的机制:q RT-PCR及Westernblot检测敲低lnc01021后对MDR1、CTR1、Bcl-2、Bax的表达的影响。结果1.顺铂作用48h,A549细胞IC50为37.5μM,A549/DDP细胞IC50为420μM,耐药指数为11.2。顺铂作用72h,A549细胞IC50为16.5μM,A549/DDP细胞IC50为154μM,耐药指数为9.3。2.苦参碱对A549/DDP细胞耐药的逆转倍数是1.59。3.通过检索GEO数据库及R语言统计分析工具配合limma程序包分析并通过q RT-PCR验证得出lnc01021、PAPPA-AS1、RP11-1151B14.4在A549及A549/DDP细胞中表达差异明显,经苦参碱作用后,A549/DDP细胞中的lnc01021受苦参碱作用最明显。4.利用q RT-PCR筛选出lnc01021的干扰片段,发现si-365干扰片段干扰效果最佳,干扰后lnc01021的表达只有原来的25%。5.MTT实验结果表明:敲低lnc01021后顺铂作用A549/DDP48h的IC50由原来的400μM降为186μM,72h的IC50由原来的120μM降为85.6μM;流式细胞术结果显示敲低lnc01021后A549/DDP细胞凋亡率由敲低前的3.73±0.94%上升到21.64±2.57%,（P＜0.01）。6.q RT-PCR结果表明,敲低lnc01021后,MDR1、Bcl-2 m RNA的表达明显下调（P＜0.05,P＜0.001）,CTR1、Bax m RNA的表达明显上调（P＜0.01,P＜0.05）;7.Western blot结果表明:敲低lnc01021后,P-gp、Bcl-2蛋白表达水平明显下调（P＜0.05）,CTR1、Bax蛋白表达水平明显上调（P＜0.01）。结论长链非编码RNA在临床肺癌耐药中起重要作用,它通过调节耐药相关基因的表达发挥作用。lnc01021在耐药细胞株A549/DDP中起重要作用,可能是潜在的顺铂耐药作用靶点。1.DDP呈时间和剂量依赖性抑制A549、A549/DDP细胞的生长。48h时A549/DDP细胞耐药倍数是11.2。72h时A549/DDP细胞耐药倍数是9.3。2.苦参碱可逆转A549/DDP细胞耐药,逆转倍数是1.59。3.长链非编码RNA lnc01021在顺铂敏感细胞株A549和顺铂耐药细胞株A549/DDP中表达有显著差异（P＜0.001）;当苦参碱逆转A549/DDP细胞耐药后,其表达显著下调（P＜0.01）。4.敲低lnc01021的表达能能增加DDP的药物敏感性,并促进A549/DDP细胞的凋亡,抑制其增殖。5.敲低lnc01021的表达,可降低A549/DDP细胞系多药耐药基因1（MDR1）及其蛋白产物P-gp蛋白表达,可减少药物的外排,增强药物敏感性;可促进铜转运蛋白1（CTR1）表达,增强药物进入细胞,进而增强药物敏感性;可降低Bcl-2/bax的表达,启动细胞凋亡,增强癌细胞凋亡能力。
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