海洋来源的生物质因为来源不占用耕地，便于获得等优势，越来越受到人们的重视。琼胶寡糖作为主要的海洋多糖琼胶的降解产物，具有良好的生物活性，广泛的应用于食品，医药等方面。但是关于琼胶寡糖的研究主要局限在两个方面，首先，大部分的活性分析都是针对酸水解琼胶获得琼寡糖，而作为最广泛存在的β-琼胶酶的水解产物:新琼寡糖，却研究的较少。对于少量的新琼寡糖的研究中，都专注于将某种琼胶酶的产物活性整体研究。如果想分别研究不同聚合度的新琼寡糖，则需要多种β-琼胶酶的水解反应支持来获得不同的新琼寡糖产物。其次，对于不同水解产物的生成，其序列和结构上的研究也几乎空白。　　本课题中建立了以多种新琼寡糖的β-琼胶酶为研究对象，其中首次发现了具有外切活性产新琼四糖的β-琼胶酶。并且通过凝胶层析纯化制备了一系列的新琼寡糖，初步测定了这些寡糖的神经细胞保护活性。对于独特的产新琼四糖的β-琼胶酶，针对其和产新琼二糖β-琼胶酶序列不同，进行了插入和缺失突变获得了产物变化的突变体，并且探讨了产新琼四糖的β-琼胶酶中N端碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Module，简称CBM)的功能。　　(1)我们通过简并引物PCR从标准菌株Agarivorans gilvus WH0801中获得了3条新的GH50琼胶酶DNA片段，1条GH16家族琼胶酶DNA片度，和1条新的GH117家族的新琼二糖水解酶片段。其中通过巢式PCR的方法，获得了GH50家族和GH117家族新基因的全长，并且进行克隆。相似性比较高的GH16家族的基因，通过已知的全长序列，设计全长引物进行克隆。之后我们利用相同的方法，从本实验室筛选得到的琼胶降解菌株Agarivorans sp.OGA07中获得了1条GH50家族的新基因和2条已经被NCBI收录的GH50家族基因和1条已被报道的GH118家族的基因。这样我们就获得了一系列的琼胶降解酶，包含了6种GH50家族的β-琼胶酶，1种GH16家族的β-琼胶酶，1种GH118家族的β-琼胶酶，和1种GH117家族的α-新琼二糖水解酶。通过这些β-琼胶酶的水解产物，我们可以获得从不同聚合度的新琼寡糖。不仅如此，由于获得了新琼二糖水解酶AgaWH117，我们可以通过水解纯化后的新琼寡糖，来得到纯的内醚糖L-AHG和一系列的奇数琼寡糖。　　(2)本论文对于未见报道的来源于标准菌株Agarivorans gilvus WH0801的2种新的β-琼胶酶AgWH50A和AgWH50C，1种新的α-新琼二糖水解酶AgaWH117进行了表达和纯化，并对它们的酶学性质进行了研究。AgWH50A是一种有外切酶特征的产新琼四糖的GH50家族β-琼胶酶（第5章中的AgWH50B和它的酶解方式十分相似，但是有更多的其它的副产物）。其最适反应温度为30℃，最适反应的pH为6.0。这是首次发现的主要具有外切酶特征的产新琼四糖的GH50家族β-琼胶酶。对于研究GH50家族的酶切模式，和制各纯的新琼四糖以及新琼四糖的工业生产有着重要意义。AgWH50C是一种有外切酶特征的产新琼二糖的GH50家族的β-琼胶酶。其最适反应温度为30℃，最适反应的pH为6.0。产新琼二糖的GH50家族β-琼胶酶在整个琼脂糖代谢中起到了关键酶的作用，它是唯一一种我们知道的能够将琼脂糖水解为最小单元，新琼二糖的酶。也是琼胶酶能够水解得到的最小单元。AgaWH117是一种属于糖苷水解酶GH117家族的α-新琼二糖水解酶，可以选择性的切割新琼寡糖的还原性末端的α-1，3糖苷键，水解产生一个L-AHG和一个奇数的琼寡糖。这种酶在琼胶降解细菌中的主要功能是将产新琼二糖的GH50家族的β-琼胶酶，例如我们克隆得到的AgWH50C的水解产物新琼二糖，再进一步水解，产生L-AHG和D-GAL两种单糖，进入琼胶降解细菌的下一步代谢途径。通过这3种琼胶降解酶的酶学性质的研究，还克隆到了相似性很高的相关报道的GH16家族琼胶酶AgWH16（其水解产物在第4章得到了分析）。这4种琼胶酶组成了一个标准菌株Agarivorans gilvus WH0801从琼脂糖到单糖的完整代谢途径。　　(3)首先根据前面中获得并表达表征的几种琼胶降解酶，挑选了4种不同水解产物β-琼胶酶作为产生4种新琼寡糖反应体系必须的催化水解酶。并利用Bio-Gel凝胶层析柱，对这4种酶的酶解产物进行了分析和鉴定，并进行了分离和纯化。在获得了4种寡糖后，我们以PC12神经细胞为实验对象进行了这几种寡糖的细胞保护试验，结果表明新琼八糖在250μg/m浓度下对PC12神经细胞有着良好的保护作用。　　(4)我们研究了AgWH50B的酶学特性和酶切特点，AgWH50B是一种产新琼四糖的GH50家族β-琼胶酶。其最适反应温度为40℃，最适反应的pH为7.0。而其活性更高，反应条件相对AgWH50A更加适合工业利用琼脂糖。因此我们选择AgWH50B进行下一步的插入和删除突变。通过多重序列比对，我们确定了产四糖和产二糖的2个不同的区域，通过改变产新琼四糖β-琼胶酶AgWH50B中的这两个区域的序列，我们获得了3个突变体Ag232，Ag2cut和Ag232cut，通过反应产物的检测，发现N端221个氨基酸序列的缺失可以改变AgWH50B的水解产物的组成。通过同源建模，发现N端前221个氨基酸覆盖了一个完整的CBM结构域的氨基酸组成。这表明CBM的缺失可以导致β-琼胶酶AgWH50B水解产物的变化。CBM不仅和底物结合有关并且有调节产物生成种类的作用。