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本研究工作分为三部分:
1.对确诊为附红细胞体感染的猪无菌采集抗凝血,纯化附红细胞体及其基因组DNA,根据已报道的猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了一对特异性引物,进行PCR扩增,结果扩增出了421bp的猪附红细胞体片断,然后对扩增产物进行克隆和测序,所测序列已登录GenBank(序列号为DQ223958),并同已发表的进行同源性分析,结果表明同源性为74.8%,进一步的验证确认该序列是猪附红细胞体的16S rRNA基因的部分序列。
2.采用抗猪附红细胞体的单克隆抗体,通过IFA方法对48份疑似猪附红细胞体感染的病猪血液进行间接免疫荧光检测,并与镜检及PCR检测方法进行比较,结果显示IFA检测的阳性率为62.5%,与PCR检测阳性率为64.59%基本相符,比血涂片的瑞氏和姬姆萨染色镜检阳性率高出近30个百分点;而用猪肺炎支原体、猪链球菌和猪巴氏杆菌作的对照结果均阴性。
3.参照猪附红细胞体16s rRNA的基因序列,设计引物,分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体病原,确定特异性产物的Tm值,同时做普通PCR。结果表明:该试验特异性产物的Tm值为88.5℃,该法能检测到阳性质粒标准品的最低浓度为0.027fg/uL。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR,通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化,最终建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。