三叉神经痛是一种临床常见的神经系统疾病,主要表现为面部三叉神经分布区内反复发作的阵发性、剧烈疼痛,其病因和发病机制至今仍不明确。目前认为,三叉神经痛是由三叉神经节神经元或受损的三叉神经纤维电活动异常增高所导致。传统的控制症状药物疗效不佳,副作用明显,临床长期服用受限。而基于三叉神经微血管压迫导致神经脱髓鞘学说发展起来的三叉神经减压术及姑息性破坏术,是目前临床缓解三叉神经痛症状主要外科治疗手段。但近来的临床研究表明,外科手术治疗风险大、复发率高,且导致面部麻木等并发症,成为困惑三叉神经病理痛治疗的一大难题。显然,加强三叉神经病理痛的病因学及神经生物学机制研究,不仅有助于发现其临床治疗药物的有益靶标,并且对于提高人类生活质量和健康水平具有重大意义。三叉神经属于第五对脑神经,其感觉传入纤维主要由眼支、上颌支及下颌支组成,胞体位于三叉神经节（trigeminal ganglia,TG）内。当外界刺激产生时,激活或敏化TG内初级感觉传入神经元（TG神经元）是三叉神经痛觉信号产生及传递的第一步。研究表明,三叉神经痛的产生与初级感觉神经元重塑及兴奋性变化密切相关,发展以三叉神经感觉传入及调控关键神经元（TG神经元）为靶标、调节其功能的药物是目前三叉神经病理痛疾病治疗学研究热点之一。神经调节肽B（neuromedin B,NMB）是哺乳动物蛙肽家族中的一种神经肽,神经调节肽B受体（neuromedin B receptor,NMBR）是一种具有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体,NMB通过与细胞表面受体NMBR结合,在中枢及外周发挥着不同的生理调节功能。近年来的研究发现,NMB与疼痛的产生和传递密切相关,其受体NMBR可能参与外周敏化,但其作用机制尚不明确。那么,NMB激活NMBR是否可以影响TG神经元功能,是否参与三叉神经痛的发生,以及NMBR在三叉神经痛中的表达变化及其转录水平前的表观遗传学调控机制如何,都有待于我们深入研究及阐明。在本论文中,我们一方面将首先研究NMBR在小鼠三叉神经痛模型TG神经元中的表达及其表达调控的转录前机制;另一方面,我们将再从离子通道角度出发,研究NMBR激活对TG神经元兴奋性影响及其变化的电压门控通道调节机制。我们的研究将有助于从表观遗传学的角度进一步明确三叉神经病理痛的发病机制,同时也为探索三叉神经病理痛的临床治疗途径和研发理想药物提供新的分子靶标。第一部分:NMBR在小鼠三叉神经痛中的作用及其表达调控机制1.研究目的:（1）研究NMBR在三叉神经痛模型小鼠TG中的表达变化及其作用。（2）生物信息学软件预测筛选调控NMBR蛋白表达的相关转录因子。（3）验证三叉神经痛模型小鼠TG中转录因子Olf-1与NMBR的靶向调控关系。（4）研究转录因子Olf-1在三叉神经痛模型小鼠TG中的表达变化及其作用。（5）研究转录因子Olf-1调控NMBR表达的表观遗传调控DNA去甲基化机制。2.实验方法:（1）采用成年雄性ICR小鼠作为实验动物,分为假手术组（sham组）和手术组（CCI-ION组）,应用von Frey纤维丝检测小鼠须垫部的机械痛阈值。（2）采用逆转录PCR和western blot方法检测NMBR在小鼠TG中的表达;采用免疫荧光方法检测NMBR与NeuN、GS、NF-200、CGRP及IB4的共表达情况。（3）采用实时荧光定量PCR和western blot方法检测sham组和CCI-ION组术后,TG内NMBR mRNA及蛋白的表达变化情况。（4）检测三叉神经节内注射NMBR受体抑制剂BIM23042能否翻转三叉神经痛小鼠的机械性痛觉过敏来确定NMBR是否参与三叉神经痛的形成。（5）应用生物信息软件预测调控NMBR表达的转录因子;采用逆转录PCR和实时荧光定量PCR方法筛选参与三叉神经痛的转录因子。（6）采用实时荧光定量PCR和western blot方法检测sham组和CCI-ION组术后,TG内转录因子Olf-1 mRNA及蛋白的表达变化情况。（7）检测三叉神经节内注射Olf-1 siRNA能否翻转三叉神经痛小鼠的机械性痛觉过敏来确定转录因子Olf-1是否参与三叉神经痛的形成。（8）应用统计学分析转录因子Olf-1和NMBR两者表达是否存在相关性;采用免疫荧光方法检测转录因子Olf-1与NMBR在TG神经元上的共定位情况。（9）检测Olf-1 siRNA能否翻转三叉神经痛小鼠TG中NMBR的高表达以验证转录因子Olf-1是否可以调控NMBR的表达。（10）采用染色质免疫共沉淀方法检测转录因子Olf-1与生物信息软件预测的NMBR基因启动子区CpG岛区域结合位点的结合情况。（11）采用甲基化特异性PCR方法检测三叉神经痛小鼠TG中NMBR基因启动子区CpG岛区域的甲基化情况。（12）采用实时荧光定量PCR方法检测小三叉神经痛小鼠TG中DNA甲基转移酶的表达情况。3.实验结果:（1）CCI-ION组第14 d,小鼠机械性痛阈值显著降低,第21 d和28 d小鼠仍持续出现机械性痛觉过敏。（2）NMBR在小鼠TG中有显著的表达;NMBR与NeuN、CGRP和IB4有大量共标,说明NMBR主要分布在与疼痛相关的中小直径神经元中。（3）CCI-ION组第14 d,NMBR mRNA和蛋白表达显著升高,第21 d和28 d仍持续高水平表达;sham组NMBR表达无显著性变化。（4）三叉神经节内注射NMBR受体抑制剂BIM23042能显著缓解三叉神经痛小鼠的机械性痛觉过敏。（5）预测筛选可以调控NMBR表达并参与三叉神经痛的转录因子是Olf-1。（6）CCI-ION组第14 d,转录因子Olf-1 mRNA和蛋白表达显著升高,第21d和28 d仍持续高水平表达;sham组转录因子Olf-1表达无显著性变化。（7）三叉神经节内注射Olf-1 siRNA能显著缓解三叉神经痛小鼠的机械性痛觉过敏。（8）在三叉神经痛小鼠TG中转录因子Olf-1和NMBR两者表达呈相关性;转录因子Olf-1与NMBR共表达于小鼠TG神经元中。（9）Olf-1 siRNA能显著抑制三叉神经痛小鼠TG中NMBR的高表达。（10）在三叉神经痛小鼠TG中转录因子Olf-1与NMBR基因启动子区CpG岛区域的结合程度明显增加。（11）三叉神经痛小鼠TG中NMBR基因启动子区CpG岛区域发生显著去甲基化。（12）三叉神经痛小鼠TG中Dnmt3a表达水平显著降低,但Dnmtl和Dnmt3b的表达无显著性变化。4.小结:（1）小鼠TG中NMBR表达上调可能参与三叉神经痛的形成。（2）三叉神经痛小鼠TG中转录因子Olf-1表达上调,转录因子Olf-1可以靶向调控NMBR表达,参与三叉神经痛的形成。（3）三叉神经痛小鼠TG中NMBR基因启动子区CpG岛区域去甲基化增强,导致转录因子Olf-1与NMBR基因启动子区结合增加,从而上调NMBR表达。（4）三叉神经痛小鼠TG中NMBR基因启动子区CpG岛区域显著去甲基化可能是由于Dnmt3a表达下调,提示DNA甲基化参与调控三叉神经痛的发生发展。第二部分:NMBR对小鼠TG神经元兴奋性的影响及其离子通道机制研究1.研究目的:（1）研究激活NMBR对小鼠小直径TG神经元电压门控型离子通道的影响。（2）探究激活NMBR对小鼠小直径TG神经元A-型钾通道电流作用及胞内信号通路机制。（3）探究A-型钾通道是否参与NMBR影响小鼠小直径TG神经元兴奋性。（4）探究A-型钾通道是否参与NMBR对小鼠外周痛觉的调控。2.实验方法:急性分离小鼠TG神经元细胞,采用全细胞膜片钳（电压钳）技术记录小直径TG神经元中的钠电流和钾电流,采用全细胞膜片钳（电流钳）技术记录小直径TG神经元的动作电位,细胞破膜后3分钟于细胞外液中给药（NMB）,再进行记录。（1）研究NMB对钠电流,A-型钾电流以及延迟整流型钾电流的影响。（2）记录 1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、1000 nM NMB 对 A-型钾电流的影响,研究NMB是否以剂量依赖性方式下调A-型钾电流。（3）研究NMB对A-型钾电流电生理特性（I-V曲线、激活曲线、失活曲线）的影响。（4）孵育NMBR拮抗剂、G蛋白活性抑制剂、Gsα阻断剂、Gi/oα阻断剂、PKA/PI3K/PLC/PKC阻断剂,研究NMB对A-型钾电流的影响,探究NMB下调A-型钾电流的胞内信号通路机制。（5）采用逆转录PCR和western blot方法验证四种novel PKC亚型在小鼠TG中的表达;孵育novel PKC亚型（η,ε,δ,θ）阻断剂,研究NMB对A-型钾电流的影响,探究哪一个novel PKC亚型参与NMB下调A-型钾电流。（6）采用western blot方法研究NMB导致MAPK蛋白激酶家族（p38、ERK1/2、JNK）的磷酸化情况,探究MAPK蛋白激酶家族哪一个成员是NMBR以及PKC下游参与NMB下调A-型钾电流。（7）研究NMB对小鼠TG神经元兴奋性的影响;孵育NMBR拮抗剂、A-型钾通道阻断剂,研究NMB对小鼠TG神经元兴奋性的影响。（8）检测三叉神经节内注射NMB后小鼠机械性痛阈值的变化情况;三叉神经节内预先注射NMBR拮抗剂或A-型钾通道阻断剂,检测注射NMB后小鼠机械性痛阈值的变化情况。3.实验结果:（1）NMB对钠电流和延迟整流型钾电流无任何影响,NMB可以显著降低A-型钾电流。（2）NMB以剂量依赖性方式下调A-型钾电流。（3）NMB显著下调A-型钾电流I-V曲线,并使稳态失活曲线显著超极化,但对稳态激活曲线无任何影响。（4）NMBR介导NMB通过Gi/oα-PKC信号通路下调A-型钾电流。（5）四种novel PKC亚型在小鼠TG中均有表达;PKCθ亚型参与NMB下调A-型钾电流。（6）NMB可以导致MAPK p38发生磷酸化,MAPK p38的确是NMBR及PKC下游参与NMB下调A-型钾电流。（7）NMB可以显著增强小鼠TG神经元兴奋性,NMBR拮抗剂以及A-型钾通道阻断剂可以翻转NMB增强小鼠TG神经元兴奋性,说明A-型钾通道参与NMBR影响小鼠TG神经元兴奋性。（8）NMB可以显著降低正常小鼠机械性痛阈值,NMBR拮抗剂可以翻转NMB降低正常小鼠机械性痛阈值,A-型钾通道阻断剂导致NMB不再使小鼠机械性痛阈值更加降低,说明A-型钾通道参与NMBR对小鼠外周痛觉的调控。4.小结:（1）NMB激活NMBR,活化下游Gi/oα-PKCθ-p38信号通路,从而下调A-型钾电流。（2）A-型钾通道参与NMBR影响小鼠TG神经元兴奋性。（3）A-型钾通道参与NMBR对小鼠外周痛觉的调控。结论:三叉神经损伤可以引起TG中特异调控NMBR表达的转录因子Olf-1表达上调,同时也引起TG中Dnmt3a表达下调,导致NMBR基因启动子区CpG岛区域去甲基化,NMBR基因启动子区的去甲基化增加了转录因子Olf-1和NmBR基因启动子区之间的结合,从而促进了基因转录,促使NMBR表达上调。NMBR的激活可活化下游Gi/oα-PKCθ-p38信号通路,从而下调A-型钾电流,进而增加TG神经元的兴奋性,最终参与三叉神经痛的发生。