广陈皮源功能细菌菌株的筛选与鉴定

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广陈皮(Pericarpium Citri Reticulatae‘Chachiensis’),是产自广东新会地区芸香科植物茶枝柑的陈化果皮,在东亚及东南亚地区被用作高级的食品调味品和传统药材,属药典所述“道地陈皮”。作为天然陈化的产物,广陈皮中具有丰富的细菌群落,是有待探索的功能菌株重要来源。本研究选取了多个厂家多个年份的广陈皮,对其中存在的细菌菌株进行大批量分离、纯化和鉴定;分别从益生菌特性和抗菌活性两个角度对分离出的细菌进行筛选评估和分析鉴定,以挖掘广陈皮中潜在的功能菌株。利用16S rRNA测序对广陈皮中分离出的64株细菌进行鉴定,在目水平分为2类,芽孢杆菌目和乳杆菌目;进一步分属4个科,芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科、球菌科以及乳杆菌科;最终汇聚于10个属。其中属于芽孢杆菌属(Bacillus)占比最大,49株芽孢杆菌覆盖33个菌种,且所有菌株鉴定相似度范围为95%-100%。通过安全性和胃肠耐受性对64株细菌进行初筛,最终基于非溶血性、在胃肠道应激下具有生存力以及不产生物胺等特性筛选出8株菌株:其中3株属于芽孢杆菌属,3株属于乳杆菌属,其余属于芽孢杆菌目。进一步研究了它们的益生菌特性、降胆固醇潜力和碳水化合物利用能力。这8株菌株都具备益生菌基本特征,包括胃肠耐受能力、自聚集性和疏水性诠释的粘附能力以及抗生素耐药安全性。与其它菌株相比,Bacillus licheniformis N17-02展示出更为显著的胆固醇去除能力,且含有胆盐水解酶相关基因,因此是一株具有降低胆固醇潜力的益生菌候选菌株。Bacillus megaterium N17-12的碳水化合物利用能力最为广泛,因此认为该菌株作为益生菌或者发酵食品、饲料的发酵剂有很大潜力。进而以抗菌活性为基点,对64株细菌进行抑菌活性筛选,其中菌株Bacillus pumilus X14-67对金黄色葡萄球菌有最优的抑菌活性。排除酸性物质和过氧化氢的干扰,发现提取浓缩后的菌株混养上清液对胃蛋白酶和蛋白酶K有一定程度的敏感性,且不耐80℃以上的高温。对该菌株进行全基因测序,组装得到了全长3714404 bp、GC含量为41.82%的染色体基因组完成图,与Bacillus pumilus(NZ CP016784.1)的16S r RNA序列相似度为100%。GO、COG以及KEGG注释发现菌株中含有大量与翻译、转录和跨膜运输蛋白相关的基因,且与代谢有关的通路占比最多,推测这些与抗菌物质的合成、转运和分泌密切相关。从功能基因注释分析,大量的糖苷水解酶、碳水化合物酯酶以及糖基转移酶存在于碳水化合物代谢通路,氯霉素和青霉烷类耐药基因以及侵袭力毒力因子和弱毒性内毒素基因的存在体现了菌株的自我保护力、适应力和生存力。从代谢通路的角度分析,该菌株具备较为完整的番茄红素、卡那霉素水解物以及芽孢杆菌素生物合成通路,可能对其抑菌活性有贡献。利用anti SMASH软件对次级代谢产物合成基因簇进行预测,发现了具有合成类似环肽类抗菌物质Lichenysin、抗菌活性铁载体Bacillibactin和以Uberolysin/Circularin A为核心环形细菌素的次级代谢产物合成基因簇。结合抗菌活性表型和基因型分析预测,认为菌株可能存在铁离子竞争抑制和抑菌素抑制两种机制,且分泌的抑菌物质可能为蛋白质和非蛋白物质的混合物。综上所述,本研究首次对从广陈皮中分离到的细菌菌株进行功能菌株的筛选和鉴定,证明了广陈皮是功能菌株的重要来源,为后续广陈皮功能特性研究提供了新视角。
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