【摘 要】
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龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）是我国传统可食用的经济型海藻,富含多糖、蛋白质、脂肪酸、氨基酸等多种功能性成分。课题组前期研究发现,龙须菜多糖具有多种生物活性。然而,由于水提龙须菜多糖溶解性差、分子量高和黏度大,其应用受到极大限制。因此,本论文创新性地采用UV/H2O2方法降解龙须菜多糖,研究不同处理时间对龙须菜多糖结构特性的影响;采用脂多糖（LPS）诱导肠上皮细胞IEC
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龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）是我国传统可食用的经济型海藻,富含多糖、蛋白质、脂肪酸、氨基酸等多种功能性成分。课题组前期研究发现,龙须菜多糖具有多种生物活性。然而,由于水提龙须菜多糖溶解性差、分子量高和黏度大,其应用受到极大限制。因此,本论文创新性地采用UV/H2O2方法降解龙须菜多糖,研究不同处理时间对龙须菜多糖结构特性的影响;采用脂多糖（LPS）诱导肠上皮细胞IEC-6建立炎症模型,筛选抗炎活性最好的组分进行分离纯化;采用高效液相色谱法（HPLC）、红外光谱（FT-IR）、扫描电镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）和核磁共振波谱（NMR）等方法,对纯化后的龙须菜多糖各组分进行结构表征;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时定量PCR（RT-q PCR）、细胞划痕和流式细胞术,探究龙须菜多糖抗炎和保护肠道屏障功效。研究结果可为龙须菜多糖在食品和保健品领域的进一步开发利用奠定理论基础,主要研究结果如下:（1）通过水提法制备得到龙须菜粗多糖（GLP）,再采用UV/H2O2方法降解粗多糖,分析不同UV辐照时间对降解产物化学组成和理化特性的影响。结果表明,UV/H2O2处理30 min后龙须菜多糖的总糖、蛋白质和糖醛酸含量下降,而硫酸基含量变化不显著（p>0.05）;UV/H2O2分别处理5、15和30 min后降解产物（5-GLP、15-GLP和30-GLP）的分子量分别为351.76、108.37和48.62 k Da龙须菜粗多糖的分子量为>700 k Da);龙须菜多糖降解前后的单糖组成种类没有变化,但降解产物的半乳糖占比增大,葡萄糖和半乳糖醛酸的占比降低。UV/H2O2处理可降低龙须菜多糖的粒径和表观粘度,改变其微观形貌;红外光谱结合I2-KI分析显示,多糖降解前后的官能团未发生显著变化,表明龙须菜多糖的降解可能是由于UV/H2O2体系中自由基攻击多糖主链中的糖苷键。（2）构建LPS诱导肠上皮细胞IEC-6炎症模型,通过测定细胞产生NO、TNF-α和IL-6的含量,筛选得到抗炎活性最佳的龙须菜多糖降解产物5-GLP。采用DEAE Sepharose Fast Flow琼脂糖凝胶柱层析对5-GLP进行分离纯化,选取回收率较高的三个组分（GLP-1.0M、GLP-1.4M和GLP-1.6M）,各组分的回收率分别为8.95%、10.56%和21.37%。（3）对上述所得三个龙须菜多糖纯化组分的化学组成和结构特性进行研究,结果显示,GLP-1.0M、GLP-1.4M和GLP-1.6M的硫酸基含量由低到高（表明随着洗脱溶剂Na Cl浓度增加,所得纯化组分酸性增大）,各组分几乎不含蛋白质。其中GLP-1.6M的分子量均一性最好,分子量为250.39 k Da。三个多糖纯化组分的微观形貌与纯化前相差较大,且组分GLP-1.6M原子力显微镜二维图谱呈现弯曲的链状,粗糙度相较纯化前的降解产物5-GLP有所增大。FT-IR和NMR分析显示GLP-1.6M是一种典型的硫酸红藻多糖,具有β-（1→3）和α-（1→4）连接的半乳糖基残基的线性骨架,且β型糖苷键含量比α型糖苷键含量多。（4）采用LPS诱导肠上皮细胞IEC-6炎症模型,通过ELISA和RT-q PCR探究龙须菜多糖抗炎活性。结果显示,龙须菜多糖降解产物5-GLP和各纯化组分GLP-1.0M、GLP-1.4M、GLP-1.6M均可以显著抑制IEC-6细胞中NO和促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的产生。GLP-1.6M组分可以下调IEC-6细胞中诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、Toll样受体4（TLR-4）和细胞促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）等基因的表达,上调抗炎因子（IL-10）的基因表达,从而发挥抗炎活性。结果表明,GLP-1.6M可能是通过调控TLR-4/NF-κB途径来缓解炎症反应。（5）通过RT-q PCR、细胞划痕实验和流式细胞术,探究龙须菜多糖对肠道屏障的保护作用。结果显示,GLP-1.6M可以上调粘液素（MUC-2）和紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）的基因表达来增强肠道屏障功能。龙须菜多糖降解产物5-GLP和纯化组分GLP-1.6M可以通过促进IEC-6细胞迁移和细胞增殖来保护肠道屏障。
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