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绵羊的泌乳性状是一个重要的经济性状,它显著影响了后代羔羊的成活率和生长速度等性能。乳腺发育程度以及乳腺上皮细胞的数量和分泌活性直接决定了母羊的产奶量和乳成分。microRNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一类非编码小RNA分子,它们在动物泌乳性状调控方面发挥了重要作用。课题组前期采集了泌乳高峰期和空怀期小尾寒羊的乳腺组织,进行了small RNA-Seq,在两组间发现了23个差异表达miRNAs,其中miR-221和miR-329b-3p在空怀期乳腺中的表达量显著上调。因此,本研究以这两个miRNAs为研究对象,首先用实时荧光定量PCR(Reverse Transcription-Quantitative PCR,RT-qPCR)验证了它们的表达量,用CCK-8试剂盒检测了它们对绵羊乳腺上皮细胞增殖的影响,其次预测了它们的靶基因,分析了靶基因的GO和KEGG功能富集。最后用双荧光素酶报告实验和RT-qPCR等方法,验证了miR-221和miR-329b-3p与预测靶基因IRS1的靶向关系,并研究了miR-221和miR-329b-3p对靶基因IRS1及IRS1参与的PI3K/AKT和MAPK信号通路下游功能基因的影响。主要研究结果如下:1.经RT-qPCR检测,miR-221和miR-329b-3p在空怀期乳腺组织中的表达量分别是泌乳高峰期的2.23和2.15倍。2.用miRDB和miRnada两种数据库,预测到miR-221和miR-329b-3p分别有33和19个靶基因,其中IRS1是它们的共同靶基因。3.CCK-8试剂盒检测发现,过表达miR-221可以抑制绵羊乳腺上皮细胞的增殖(P<0.01),而沉默miR-221可以促进绵羊乳腺上皮细胞的增殖(P<0.01)。miR-329b-3p对乳腺上皮细胞的作用与miR-221相同。4.分别过表达miR-221和miR-329b-3p,均可抑制野生型载体IRS1基因3′UTR的双荧光素酶相对活性(P<0.05),而分别沉默这两个miRNAs,均可增加野生型载体IRS1基因3′UTR的双荧光素酶相对活性(P<0.05);与阴性对照组相比,分别过表达及沉默这两个miRNAs,对突变型载体IRS1基因3′UTR的双荧光素酶相对活性无影响(P>0.05)。表明miR-221和miR-329b-3p与IRS1基因间存在靶向关系。5.过表达miR-221降低了乳腺上皮细胞中IRS1的表达量(P<0.05),沉默miR-221提高了IRS1的表达量(P<0.05)。miR-329b-3p对IRS1表达量的影响与miR-221相同。6.过表达miR-221降低了MAPK8和PIK3R1的表达量(P<0.05),沉默miR-221提高了它们的表达量(P<0.05);过表达miR-329b-3p降低了MAPK8和IGF1R的表达量(P<0.05),沉默miR-329b-3p提高了它们的表达量(P<0.05)。7.绵羊IRS1基因的CDS全长为3708bp,编码1235个氨基酸。该基因在小尾寒羊乳腺等8个组织中都表达,并表现出明显的组织特异性和时空特异性。综上所述,miR-221和miR-329b-3p不但能抑制绵羊乳腺上皮细胞的增殖,还抑制了靶基因IRS1、及其所在信号通路下游基因IGF1R、PIK3R1和MAPK8的表达。